PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑使用說明

PolyShooter INTERFERE Transfection Reagent

For the transfection of siRNA/miRNA into animal cells

CatalogNumber：P09410

01/產(chǎn)品概述

　　RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域重大的發(fā)現(xiàn)之一，它是指小分子雙鏈RNA可以特異性地降解同源mRNA，從而抑制或關(guān)閉特定基因表達(dá)的現(xiàn)象。人們只要知道了某種疾病的致病基因，就可以設(shè)計(jì)出針對(duì)該基因mRNA的小分子干擾RNA（SmallinterferingRNA，siRNA），抑制或封閉該致病基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤等基因治療領(lǐng)域。RNAi是目前熱門的生命科學(xué)研究領(lǐng)域，也是未來有發(fā)展前途的新藥開發(fā)領(lǐng)域。除此之外，RNAi技術(shù)還可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)和漁業(yè)等多種領(lǐng)域，進(jìn)行良種培育、良種篩選和疾病治療等。

　　 siRNA/miRNA導(dǎo)入有以下幾種方法∶化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術(shù)、顯微注射和載體導(dǎo)入技術(shù)。由于電轉(zhuǎn)的方法對(duì)細(xì)胞損傷比較大，一般不建議選擇電轉(zhuǎn)。化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)是目前常用的方法，化學(xué)轉(zhuǎn)染能否成功的關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)染試劑的選擇。

　　 PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410，即PolyShooter INTERFERE Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑，適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染。其原理為帶正電的高分子聚合物與siRNA/miRNA帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后，與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)含體。該轉(zhuǎn)染試劑具有質(zhì)子海綿的作用，能夠吸收溶酶體中的H+，質(zhì)子的不斷流入導(dǎo)致復(fù)合體腫脹破裂，從而使外源siRNA或miRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，實(shí)現(xiàn)siRNA/miRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

　　PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑 P09410 對(duì)多種常見細(xì)胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率，具有高效低毒、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用siRNA/miRNA介導(dǎo)的基因抑制實(shí)驗(yàn)。其*的配方使其轉(zhuǎn)染后無明顯細(xì)胞毒性，因此無需去除轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基，也可根據(jù)具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運(yùn)輸。4℃保存，有效期6個(gè)月。-30℃至-10℃保存，有效期12個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

　　轉(zhuǎn)染效率高——針對(duì)廣泛類型的細(xì)胞，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率，基因抑制效果好，脫靶效應(yīng)低

　　細(xì)胞毒性低——作用溫和，能較好地實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性之間的平衡

　　適用范圍廣——可用于多種細(xì)胞類型，適合siRNA/miRNA介導(dǎo)的基因抑制實(shí)驗(yàn)

　　操作簡(jiǎn)單——簡(jiǎn)單快速的實(shí)驗(yàn)方案，可獲得穩(wěn)定的結(jié)果，且轉(zhuǎn)染后無需去除復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基

05/適用范圍

　　LeapWal PolyShooter siRNA/miRNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑，適用于siRNA和miRNA的轉(zhuǎn)染。

06/實(shí)驗(yàn)流程概要

07/實(shí)驗(yàn)步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)）

1: 準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細(xì)胞

貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，將胰酶消化后的細(xì)胞按照每孔0.1-1x10⁵個(gè)細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為30%-40%。

懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前，在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板，每500 µL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入0.5-2.5x10⁵個(gè)細(xì)胞。

Ø 細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)，建議使用生長(zhǎng)處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2: 準(zhǔn)備PolyShooter^TM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物

（1）取1 μL siRNA (20 μM，DEPC水溶解) 加入到1.5 mL離心管中，加入2 μL PolyShooter^TM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑與siRNA混合，室溫孵育3分鐘。

Ø 基因性質(zhì)、細(xì)胞類型、siRNA效價(jià)、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周轉(zhuǎn)率等因素均會(huì)影響siRNA的轉(zhuǎn)染效率，建議選取siRNA作用濃度在10-100 nM之間，轉(zhuǎn)染試劑的體積應(yīng)根據(jù)siRNA濃度和培養(yǎng)皿的大小進(jìn)行調(diào)整，請(qǐng)參見表一。

（2）往上述混合物中加入100 μL Opti-MEMTM I減血清培養(yǎng)基（無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

3: siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染

30分鐘后，將上述100 µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。

4. 分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因干擾效率

轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時(shí)后，可根據(jù)實(shí)際情況用RT-PCR、Western Blot、ELISA、熒光檢測(cè)法、流式細(xì)胞術(shù)、報(bào)告基因等檢測(cè)基因干擾效果，或進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

Ø 該轉(zhuǎn)染試劑也適合轉(zhuǎn)染miRNA，具體操作請(qǐng)參考siRNA的操作流程。

表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)

08/注意事項(xiàng)

1.核酸質(zhì)量：確保siRNA/miRNA是經(jīng)過PAGE純化和脫鹽處理的，高純度的siRNA/miRNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。

2.細(xì)胞質(zhì)量：細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率，建議使用生長(zhǎng)處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3.細(xì)胞密度：建議細(xì)胞傳代后12-24h內(nèi)、細(xì)胞密度為30%-40%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進(jìn)行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時(shí)，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中保證相同的接種條件，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。

4. siRNA與轉(zhuǎn)染試劑使用比例：對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系而言，轉(zhuǎn)染復(fù)合物中siRNA (μL of 20 μM Stock)與PolyShooter^TM INTERFERE Transfection Reagent (μL) 的比例在1：1至1：3之間，推薦比例為1:2。想要獲得理想的基因干擾結(jié)果，需要對(duì)這一比例進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞及siRNA選擇適合的轉(zhuǎn)染比例。

5. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會(huì)抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測(cè)特殊培養(yǎng)基與PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent的相容性。

6. 轉(zhuǎn)染前，確保siRNA/miRNA基因沉默表達(dá)不會(huì)影響細(xì)胞活力。

7. 您需要設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因的若干siRNA（小干擾RNA），并評(píng)估其效價(jià)。

8. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程使用無RNA酶和無熱原性的材料，如離心管、槍頭、緩沖液。

9. 為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)。

10. 本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

09/實(shí)驗(yàn)案例分析

1: 轉(zhuǎn)染前一天，將穩(wěn)定表達(dá)GFP的HeLa細(xì)胞接種于24孔板，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為30%。

2: 按照每孔計(jì)量，取1μL siRNA(GFP/NC, 20 μM)加入到1.5 mL離心管中，再加入2 μL PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent與siRNA進(jìn)行混合，室溫孵育3 min。

3: 往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM^TM I減血清培養(yǎng)基（不含血清不含雙抗），輕輕混勻，在室溫條件下靜置30 min，形成PolyShooter^TM INTERFERE轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

4: 30分鐘后，將上述100 µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。

5: siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP綠色熒光蛋白干擾效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

6: 說明：此次實(shí)驗(yàn)選擇商業(yè)化的 siRNA轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX作為對(duì)照組，RNAiMAX的具體實(shí)驗(yàn)操作按照其說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)單來說：在不含抗生素的50 μL 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋1μL siRNA(GFP, 20 μM)，輕輕混勻。然后，在不含抗生素的50 μL 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋1μL RNAiMAX，輕輕混勻。將稀釋的siRNA與稀釋的RNAiMAX輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘。將混合物添加到細(xì)胞中，其終體積為600μL。siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP綠色熒光蛋白干擾效果。

圖2: siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡(A)及流式細(xì)胞儀(B)檢測(cè)GFP干擾效果

10/其他相關(guān)產(chǎn)品