PolyShooter Protein Transfection Reagent

For the transfection of biologically active proteins and peptides.

Catalog Number：P19103

01/產品概述

蛋白質轉染是將生物學上有活性的蛋白質或肽段導入活細胞，通過替換體內具有缺陷或缺失的蛋白而發(fā)揮治療作用的新型手段。與傳統(tǒng)小分子化合物藥物相比，蛋白質藥物具有更強的特異性和效用，在低濃度時就可以表現(xiàn)出高特異性和高活性。此外，在活細胞內遞送蛋白質能夠獲得比基因轉染更迅速的蛋白表達，是核酸轉染的替代方式，可作為一種功能強大的研究方法或治療策略，廣泛應用于生命科學領域。

基于肽轉導結構域（PTD）的技術已成功開發(fā)用于蛋白質的胞內轉染。然而，這些PTD與蛋白質的相互作用較差，通常需要蛋白質和PTD之間形成共價連接。目前已開發(fā)出多種試劑用于蛋白質的胞內轉染，如基于多肽、陽離子脂質和聚合物的轉染試劑。這些轉染試劑主要是通過非共價相互作用與蛋白質形成復合物，然后通過胞吞作用進入細胞，這些蛋白質復合物通常會進入內涵體中，如果不能及時從內涵體中釋放，蛋白質就會在內涵體發(fā)展成為溶酶體后，在溶酶體中發(fā)生降解。因此，轉染試劑應該有很強的破膜活性，從而保證轉染蛋白能夠從內涵體中釋放進入細胞質并發(fā)揮作用。

PolyShooter Protein Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型蛋白轉染試劑，適用于幾百Da的小分子多肽到幾百kDa的大分子蛋白質的轉染。其原理為帶正電的陽離子高分子轉染試劑與蛋白質通過靜電相互作用、疏水相互作用以及氫鍵相互作用等多種非共價相互作用的協(xié)同作用與蛋白質結合形成帶正電的復合物，之后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內吞作用進入細胞。在內涵體熟化過程中，隨著pH值的降低，陽離子高分子轉染試劑與內涵體膜的相互作用增加，導致內涵體膜的破裂，從而將蛋白質釋放入細胞質中發(fā)揮作用。由于轉染試劑通過非共價形式與蛋白質結合形成復合物，因此不會干擾蛋白質的生物學活性。

PolyShooter Protein Transfection Reagent對多種常見細胞具有高水平轉染效率，具有高效低毒、操作簡單、重復性好等優(yōu)點。另外，由于該陽離子高分子轉染試劑與蛋白質是通過多種非共價相互作用協(xié)同結合蛋白質的，因此可以適用于各種理化性質的蛋白質轉染。PolyShooter Protein Transfection Reagent可用于細胞信號傳導和凋亡檢測、蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白質定位和隔室穿梭等各種功能研究。

02/產品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復凍融。

04/產品特點

蛋白轉染效率高——針對廣泛類型的細胞，蛋白質轉染效率高

蛋白活性高——與蛋白質非共價結合，遞送后的蛋白和肽仍具有高生物學活性

細胞毒性低——作用溫和，生物相容性好

操作簡單——簡單快速的實驗方案，無需分離、克隆和轉染基因序列；孵育后3-12小時內可獲得穩(wěn)定的蛋白轉染效果

適用范圍廣——適用于各種理化性質的蛋白質轉染

05/適用范圍

PolyShooter Protein Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型蛋白轉染試劑，對多種常見細胞具有高水平轉染效率，適用于幾百Da的小分子多肽到幾百kDa的大分子蛋白質及各種理化性質的蛋白質轉染。

06/實驗流程概要

07/實驗步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉染量度標準）

1: 準備待轉染細胞

貼壁細胞：轉染前一天，將胰，酶消化后的細胞按照每孔1-3x10^5個細胞的量進行鋪板，使其在轉染時密度為 50%-100%。

懸浮細胞：轉染當天，配制轉染試劑-蛋白質復合物之前，在24孔板中進行細胞鋪板，每500 µL生長培養(yǎng)基中加入2-6x10^5個細胞。

? 細胞狀態(tài)會極大影響轉染效率，待轉染細胞應處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數期、存活率大于90% 的細胞進行轉染。

2: 準備PolyShooter Protein轉染試劑-蛋白質復合物

（1）取1-10 μg 蛋白質加入到1.5 mL離心管中，加入1-3 μL PolyShooter Protein轉染試劑與蛋白質混合，室溫孵育3分鐘。

? 蛋白質的實際使用量需根據蛋白質的類型和具體實驗進行優(yōu)化，不同性質的蛋白質使用量相差較大，例如：熒光蛋白EGFP建議24孔板使用量為5-10 μg，熒光蛋白Phycoerythrin建議24孔板使用量為0.5-2 μg，凋亡蛋白Saporin建議24孔板使用量為0.1-1 μg。

? 轉染試劑的用量應根據目的細胞類型、接種細胞密度、培養(yǎng)皿的大小進行調整，請參見表一。

（2）往上述混合物中加入100 μL無血清基礎培養(yǎng)基1（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置20分鐘，形成轉染試劑-蛋白質復合物。

（3）20分鐘后，往轉染試劑-蛋白質復合物中加入400 μL無血清基礎培養(yǎng)基2（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗）稀釋復合物。

3: 蛋白質轉染

棄去細胞培養(yǎng)基，用預熱的PBS清洗細胞1-2次，將上述500 µL轉染試劑-蛋白復合物加入每孔細胞進行蛋白質轉染。

4. 分析蛋白質轉染效果

轉染試劑-蛋白復合物與細胞孵育3-12小時后，可根據實際情況，用熒光檢測法、流式細胞術、Western Blot、免疫熒光染色等實驗方法進行后續(xù)檢測及分析。

表一：轉染量度標準

08/注意事項

1. 蛋白質質量：蛋白質中存在的雜質、污染物和添加劑都可能會影響蛋白質遞送效率，我們建議使用盡可能高純度的蛋白質樣品。

2. 細胞質量：細胞狀態(tài)會極大影響轉染效率，建議使用生長處于指數期、存活率大于90%的細胞進行轉染。

3. 細胞密度：建議細胞傳代后12-24 h內、細胞密度為50%-100% 時進行轉染。不同的蛋白轉染實驗，對細胞密度的要求不盡相同。在進行不同蛋白質或不同細胞系的轉染時，需要根據說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外，在實驗過程中需保證相同的接種條件，確保實驗數據的可重復性。

4.蛋白質與轉染試劑使用量：蛋白質的實際使用量需根據蛋白質的類型和具體實驗進行優(yōu)化，不同性質的蛋白質使用量相差較大。轉染試劑的用量應根據目的細胞類型、接種細胞密度、培養(yǎng)皿的大小進行調整（參見表一）。想要獲得更好的蛋白遞送效果，需對蛋白質及轉染試劑的使用量進行優(yōu)化，選擇適合的劑量。

5. 采用無血清轉染體系進行蛋白質轉染可獲得高效的蛋白質遞送效果，這是因為血清中的血清蛋白會通過競爭結合蛋白轉染試劑，從而影響轉染試劑-蛋白質復合物的形成和穩(wěn)定性。

6. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導的轉染，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooter Protein Transfection Reagent的相容性。

7. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗。

8. 本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

1: 轉染前一天，將CHO、NIH-3T3、H1299和HEK293細胞分別接種于24孔板，使其在轉染時密度約為95%。

2: 按照每孔計量，取10 μg EGFP（1mg/mL）蛋白加入到1.5 mL離心管中，再分別加入1 μL、2 μL、3 μL PolyShooterTM Protein Transfection Reagent與蛋白質混合，室溫孵育3 min。

3: 往混合物中加入100 μL無血清基礎DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置20 min，形成轉染試劑-蛋白質復合物。

4: 20分鐘后，往復合物中加入400 μL無血清基礎DMEM培養(yǎng)基稀釋復合物。

5: 棄去細胞培養(yǎng)基，用預熱的PBS清洗細胞2次，將上述500 µL轉染試劑-蛋白質復合物加入每孔細胞，與細胞孵育4小時。

6: 轉染4小時后，用熒光顯微鏡檢測EGFP綠色熒光蛋白轉染效果，實驗結果如圖2所示。

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