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技術(shù)前沿 | 如何快速穿包裝鑒別寡核苷酸初始物料？
寡核苷酸
新冠疫情中，一般采用如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）快速檢測是否存在 SARS-CoV-2 。PCR 檢測的目標(biāo)是由亞磷酰胺為主體合成的核苷酸或者短鏈 RNA/DNA 分子。 亞磷酰胺單體的排列、化學(xué)改性以及數(shù)量賦予 RNA/DNA 序列特定靶向，應(yīng)用于疾病篩查、生物醫(yī)學(xué)研究和刑事等領(lǐng)域。在過去幾年，寡核苷酸應(yīng)用與日俱增，滿足質(zhì)量要求的供應(yīng)鏈日趨緊張。在 cGMP 環(huán)境下，對合成寡核苷酸的初始物料，在物料接收處進(jìn)行鑒別，以保持質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這是在寡核苷酸生產(chǎn)流程中防止原料摻假或引入劣質(zhì)原料的道防線。
本文介紹安捷倫 vaya 手持拉曼用于鑒別合成寡核苷酸的商品化物質(zhì)---亞磷酰胺。實(shí)驗(yàn)證明，在 cGMP 環(huán)境下 Vaya 可穿透透明或不透明容器有效鑒別和區(qū)分生物制藥的原輔料。
Agilent Vaya 手持拉曼采用空間位移拉曼（SORS）技術(shù)，可以直接穿透透明和不透明的容器鑒別原輔料（如圖 1 ），還可以準(zhǔn)確區(qū)分類似物，例如非對映異構(gòu)體、位置異構(gòu)體、多晶型等。
圖 1 . Vaya 直接穿透棕色玻璃瓶鑒別寡核苷酸初始物料
Vaya 直接穿透棕色玻璃瓶測試的五種亞磷酰胺（采購于 Sigma Aldrich），測試譜圖如下：
a. DMT-dA(bz) Phosphoramidite
b. DMT-dT Phosphoramindite
c. DMT-dG(ib) Phosphoramidite
d. DMT-dA(bz)-CPG
e. DMT-2’O-Methyl-rA(bz) Phosphoramidite
圖 2 . 5 種亞磷酰胺的拉曼譜圖
從圖 2 看出，c 和 d 的兩種亞磷酰胺在 1000-1500cm-1 范圍有明顯特征峰，容易和其他四種亞磷酰胺區(qū)分，而其他三種亞磷酰胺就很相似，對于拉曼鑒別就具有一定挑戰(zhàn)。Vaya 手持拉曼采用雙參數(shù) R2 和 LMC 同時(shí)評判測試結(jié)果是 Pass 還是 Fail ，相比單一參數(shù)評判，更容易區(qū)分相似組分。更重要的是，Vaya 在建模過程中還具備添加相似組分的功能，讓其區(qū)分相似組分的能力更加強(qiáng)大。
建模時(shí)不添加相似組分
如圖 3 是建模不添加相似組分的 5 種亞磷酰胺的交叉驗(yàn)證結(jié)果。直接隔著棕色玻璃瓶分別對每一種亞磷酰胺建模（此時(shí)沒有將其他 4 種亞磷酰胺作為相似組分添加入模型），再用每一個(gè)模型分別去驗(yàn)證 5 種亞磷酰胺。理想情況應(yīng)該是，只有每一個(gè)模型驗(yàn)證自身時(shí)，結(jié)果是 Pass ，而驗(yàn)證其他四種亞磷酰胺時(shí)，結(jié)果均是 Fail 。實(shí)際結(jié)果表明，在不添加相似組分時(shí)，由于其中幾種亞磷酰胺相似度太高，Vaya 不能穩(wěn)定的區(qū)分這 5 種亞磷酰胺。于是下一步就在建模中采用添加相似組分的功能。
圖 3 . 不添加相似組分時(shí) 5 種亞磷酰胺的交叉驗(yàn)證結(jié)果
建模時(shí)添加相似組分
如圖 4 是采用添加相似組分功能后 5 種亞磷酰胺的交叉驗(yàn)證結(jié)果。直接隔著棕色玻璃瓶分別對每一種亞磷酰胺建模，并將其他 4 種亞磷酰胺作為相似組分添加入模型中，啟動(dòng)更智能的算法，再用每一個(gè)模型分別去驗(yàn)證 5 種亞磷酰胺。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每種亞磷酰胺模型只在驗(yàn)證測試自身時(shí)，結(jié)果是 Pass，驗(yàn)證測試其他四種物質(zhì)時(shí)都顯示 Fail。說明在采用添加相似組分功能后，Vaya 可以直接隔著棕色玻璃瓶穩(wěn)定鑒別區(qū)分亞磷酰胺物質(zhì)。
圖 4 . 添加相似組分時(shí) 5 種亞磷酰胺的交叉驗(yàn)證結(jié)果
結(jié)語
安捷倫 Vaya 手持拉曼，無需打開容器，在物料接收處，只需幾秒即可直接驗(yàn)證亞磷酰胺，快速判斷其是否被裝錯(cuò)。Vaya 也同樣適用于生物制藥其他原輔料的驗(yàn)證。