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藥用輔料分析與質(zhì)量控制——無需前處理，基于LC-Q/TOF AIM方法表征吐溫中脂肪酸組成及相對(duì)含量
聚山梨酯，商品名吐溫，親水性和化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，添加到藥物制劑中，可提高活性成分的溶解度，同時(shí)抑制大分子蛋白藥物的自動(dòng)聚合，可以提高蛋白藥物的穩(wěn)定性，是目前抗體制劑配方中常用的表面活性劑。
從 EP、USP、ChP 等現(xiàn)行藥典方法看，吐溫類輔料的質(zhì)量控制均包括測(cè)定脂肪酸組成及含量，采用氣相色譜法，將吐溫水解并酯化后測(cè)試。該方法前處理較為復(fù)雜，需要多種脂肪酸酯標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)。
為了進(jìn)行更方便、快速的檢測(cè)，滿足日益增長(zhǎng)的輔料評(píng)估和制劑研發(fā)需求，開發(fā)了一種基于 LC-Q/TOF AIM（全離子 MS/MS，All Ions MS/MS）模式分析吐溫中脂肪酸組成的方法，無需樣品前處理，不需要脂肪酸標(biāo)品，可快速確定脂肪酸組成及相對(duì)含量。本方法適用于吐溫中脂肪酸的快速判斷，為吐溫的精細(xì)表征提供指導(dǎo)。
實(shí)驗(yàn)條件
吐溫輔料樣品直接稀釋后檢測(cè)。
大分子制劑可采用乙腈沉淀去除蛋白后檢測(cè)，如需濃縮建議氮吹后復(fù)溶。
色譜柱
C4 色譜柱 (2.1X100mm, 1.7μm)
流速
0.4 mL/min，梯度洗脫
流動(dòng)相
含 0.1% 甲酸和 5mM 乙酸銨的水溶液（A）；乙腈（B）
柱溫
35 °C
電離模式
ESI ，正離子
霧化氣
35 psi
干燥氣溫度
250 °C
干燥氣流量
8 L/min
鞘氣溫度
300 °C
鞘氣流量
12 L/min
毛細(xì)管電壓
4000 V
噴嘴電壓
500 V
檢測(cè)模式
All Ions MS/MS（AIM）
碰撞能量
0/40 V（低/高能量通道）
方法概要
吐溫在二級(jí)質(zhì)譜中會(huì)產(chǎn)生特征脂肪酸碎片 R-C3H4O2+，利用這些特征碎片離子，可以不借助標(biāo)準(zhǔn)品，直接判斷脂肪酸組成。那么，如何在復(fù)雜的吐溫樣品中，準(zhǔn)確全面地確認(rèn)特征碎片離子？Agilent LC-Q/TOF AIM（全離子 MS/MS，All Ions MS/MS）模式可以滿足這樣的需求。
AIM 可進(jìn)行簡(jiǎn)便的采集方法設(shè)置，無需預(yù)先選擇母離子，僅改變碰撞能量：在低能量通道中，吐溫中的化合物以原型為主，用于成分表征；高能量通道中，將吐溫幾乎完全打碎，確認(rèn)脂肪酸特征碎片的組成及相對(duì)含量。相比于傳統(tǒng)的 Auto MS/MS 或者 Target MS/MS，AIM 模式不僅采集方法設(shè)置簡(jiǎn)單，而且不存在對(duì)于低豐度、低質(zhì)量端碎片或者未指定母離子的歧視，所有母離子均可碎裂，通過具有精確質(zhì)量數(shù)的 TOF 譜圖，確認(rèn)不同的脂肪酸特征碎片信息。
本實(shí)驗(yàn)條件與吐溫精細(xì)表征的方法相同，可以在 LC-Q/TOF 系統(tǒng)中一次進(jìn)樣同時(shí)得到脂肪酸判定和詳細(xì)成分表征。脂肪酸組成信息，可以幫助我們?cè)诔煞直碚鲿r(shí)有針對(duì)性的分析對(duì)應(yīng)脂肪酸酯組分；詳細(xì)成分表征的結(jié)果，也能進(jìn)一步確認(rèn)脂肪酸組成的合理性。
結(jié)果展示
下圖展示了兩份吐溫 20 和三份吐溫 80 樣品的脂肪酸組成對(duì)比：吐溫 20 中，最主要的脂肪酸為月桂酸，占比約 40%，其它含量較高的脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕櫚酸（軟脂酸）、油酸、辛酸、癸酸等；吐溫 80 主要為油酸酯（約 98%），另外含有少量亞油酸。
結(jié)語(yǔ)
對(duì)不同吐溫樣品的脂肪酸組成和相對(duì)含量進(jìn)行分析，使用本方法得到的結(jié)果與 2020 版《中國(guó)藥典》中的要求具有可比性。本方法不依賴標(biāo)準(zhǔn)品，無需復(fù)雜的樣品前處理過程，可快速可靠地分析吐溫的脂肪酸組成和定量。適用于不同品牌、不同批次或不同工藝的質(zhì)量對(duì)比研究，并為吐溫精細(xì)表征提供脂肪酸組成的依據(jù)。