安捷倫與科邁恩以及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所合作建立了一套完整地針對(duì)吐溫組成成分及其降解雜質(zhì)的精細(xì)表征，通過(guò) UHPLC-6500 系列  Q-TOF MS 液質(zhì)聯(lián)用儀，配合 PolymerStudio 聚合物分析軟件和專用數(shù)據(jù)庫(kù)，為制劑處方篩選和工藝優(yōu)化提供了有力工具。

圖 1. 吐溫及其降解雜質(zhì)的全面快速分析方案

吐溫降解初期的表現(xiàn)之一是亞類成分發(fā)生明顯變化，這些變化通常由于吐溫的水解產(chǎn)生，pH 值和酯酶的存在可能導(dǎo)致或加速吐溫的水解，主要表現(xiàn)為高酯化成分減少、酯化度降低、聚氧乙烯（POE）等未酯化成分含量增加且聚合度降低等。

實(shí)驗(yàn)測(cè)試了吐溫 20 在制劑酸性環(huán)境下不同時(shí)間點(diǎn)的精細(xì)組成變化情況：從未酯化區(qū)域看，聚氧乙烯（POE）、聚氧乙烯異脫水山梨醇（PI）和聚氧乙烯脫水山梨醇（PS）的相對(duì)含量明顯增加，并且隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而繼續(xù)升高，聚合度也有明顯降低（可能與聚氧乙烯水解有關(guān)）。從單酯含量看，辛酸單酯、癸酸單酯和月桂酸單酯的相對(duì)含量變化較小，肉豆蔻單酯、棕櫚單酯和油酸單酯的含量隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而明顯降低。雙酯及更高酯化度的化合物，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，信號(hào)強(qiáng)度明顯減小甚至消失。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了針對(duì)吐溫 80 的酯酶水解，觀察到了未酯化成分 POE、PI 和 PS 含量的增加，聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯（PSTO）和四油酸酯（PSEO）相對(duì)含量的明顯減少，并觀察到了（異）脫水山梨醇母核水解的產(chǎn)物。另外，除了精細(xì)組成的變化，吐溫水解直接表現(xiàn)為酯化度的降低，可以從 PolyPattern 軟件分析報(bào)告中直接讀出。本例中吐溫 80 經(jīng)過(guò)酯酶水解后，平均酯化度從 1.57 降至 0.71，而平均聚合度變化較小（從 21.38 微弱下降至 19.95），表明吐溫 80 的酯酶水解，以高酯化成分水解脫油酸為主，POE 鏈幾乎沒(méi)有水解。

吐溫 80 因其脂肪酸鏈存在不飽和雙鍵，在高溫、光照和金屬離子等影響下，可能發(fā)生一系列的氧化反應(yīng)，生成脂肪酸鏈變化的氧化產(chǎn)物。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所張金蘭老師課題組今年在 Anal. Chem. 上發(fā)表文章，詳細(xì)探討了吐溫 80 的 32 類 348 種氧化雜質(zhì)，優(yōu)化了 UHPLC-Q/TOF 結(jié)合 AIM（全離子 MS/MS，All Ions MS/MS）的表征技術(shù)，建立了保留時(shí)間-結(jié)構(gòu)特征鑒別模型，將高分辨質(zhì)譜信息、同位素分布、特征碎片離子及保留時(shí)間模型應(yīng)用于吐溫 80 氧化產(chǎn)物的鑒定。

上述研究工作，已經(jīng)同步寫(xiě)入 PolymerStudio 軟件數(shù)據(jù)庫(kù)，用于吐溫 80 氧化產(chǎn)物的全面快速表征。下圖展示了某生物制劑中吐溫 80 氧化產(chǎn)物的相對(duì)含量分析，占比較高的氧化雜質(zhì)分別為聚氧乙烯脫水山梨醇單羥基油酸酯（PSMH）、聚氧乙烯異脫水山梨醇單羥基油酸酯（PIMH）和聚氧乙烯異脫水山梨醇雙羥基油酸酯（PIDH）。

圖 3. 某生物藥物中吐溫 80 各個(gè)亞類氧化雜質(zhì)的相對(duì)含量

在強(qiáng)降解等特殊實(shí)驗(yàn)中，我們可能觀察到一些未知降解產(chǎn)物。這時(shí)可以利用 Q-TOF 的未知物鑒定能力，通過(guò)準(zhǔn)確質(zhì)量和同位素信息，推測(cè)未知物的分子式，再結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜特征碎片信息，推測(cè)未知物可能的結(jié)構(gòu)。下圖展示了在吐溫 80 的強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)中，除了觀察到 POE 含量增加，聚合度降低，還出現(xiàn)了一系列 POE 的氧化產(chǎn)物，可以利用高分辨質(zhì)譜信息推測(cè)其分子式及可能的結(jié)構(gòu)。

圖 4. 吐溫 80 強(qiáng)降解實(shí)驗(yàn)后 POE/PS/PI 的對(duì)比（右圖）及推測(cè)的 POE 氧化產(chǎn)物的質(zhì)譜信息（左圖）