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磁珠提取實時熒光定量PCR異常擴增曲線分析

閱讀：718 發(fā)布時間：2022-7-11
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　　磁珠提取實時熒光定量PCR是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中*的手段，是一種敏感的放大系統(tǒng)。相比于傳統(tǒng)的臨床診斷方法，核酸診斷是分子水平上的診斷技術(shù)，可以彌補傳統(tǒng)臨床診斷方法的某些缺陷。

　　磁珠提取實時熒光定量PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于應(yīng)用了熒光探針，可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高準確性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點。

　　將傳統(tǒng)PCR檢測模式中的PCR擴增和檢測相結(jié)合（即在同一個密閉容器中將PCR擴增反應(yīng)與熒光標記探針檢測結(jié)合在一起）檢測目的核酸的檢驗方法紛紛出臺。這樣的檢測方法稱為“實時”PCR，表示PCR擴增產(chǎn)物可被實時檢測。

　　準確地說，“實時”是指在每一個PCR循環(huán)后檢測擴增產(chǎn)物，當PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后，我們可以得到每個樣品的PCR擴增產(chǎn)物變化曲線。通過分析這些反應(yīng)曲線，不但可以得到病原體的定性檢測結(jié)果，還可以對病原體的數(shù)量進行準確定量。

　　多組分圖擴增曲線沒有抬升，是很明顯的陰性樣本，但是擴增圖譜的擴增曲線抬升了，這樣就會與閾值線相交，反而有了CT值。這是由于軟件在進行基線自動扣除的時候出現(xiàn)錯誤，引起了擴增曲線抬升。

　　出現(xiàn)這種情況可以采取手動調(diào)整基線的方法，重新定義基線即可正常，即將基線起點改為熒光信號穩(wěn)定的循環(huán)數(shù)（一般是3），基線終點要改成擴增曲線起峰的前一個循環(huán)數(shù)（比如起峰是在第25個循環(huán)，那基線的終點就是24）。引起這樣的原因是由于選用的耗材、試劑或者操作的原因?qū)е帘尘盁晒庑盘栍兴▌?，從而造成反?yīng)孔的自動基線扣除錯誤。

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