實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光集團(tuán)，利用熒光信號來實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。

 

　　病原學(xué)檢測是動(dòng)物疾病確診的關(guān)鍵點(diǎn)，而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是目前病原檢測的常用的分子生物學(xué)技術(shù)，具有高敏感性的特征。PCR技術(shù)發(fā)展已日趨完善，并在此基礎(chǔ)上建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR、套式、多重、降落PCR等技術(shù)，逐漸成為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測手段。

 

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

 

　　熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了方便定量和比較，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。

 

　　熒光定量PCR的分類：

 

　　分為核酸染料法和探針法。核酸染料法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，不需要設(shè)計(jì)探針，僅需要一對引物，但是核酸染料法對雙鏈的結(jié)合并沒有特異性，容易使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽性信號。

 

　　動(dòng)保站全部采用探針法，此方法只有與探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴(kuò)增才能收集到熒光信號，增加了反應(yīng)的特異性；另外如果對探針的5’端采用不同的熒光標(biāo)記就可以進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR。