實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增是為了得到目的帶擴(kuò)大濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，單鏈DNA在互補(bǔ)寡聚核苷酸片段的引導(dǎo)下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。這時(shí)單鏈DNA稱為模板DNA，寡聚核苷酸片段稱為引物，合成的互補(bǔ)DNA稱為產(chǎn)物DNA。雙鏈DNA分子經(jīng)高溫變性后成為兩條單鏈DNA，它們都可作為單鏈模板DNA，在相應(yīng)的引物引導(dǎo)下，用DNA聚合酶復(fù)制出產(chǎn)物DNA。

 

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增使幾個(gè)DNA模板分子通過(guò)數(shù)小時(shí)擴(kuò)增后增加到百萬(wàn)倍以上，因此能用微量樣品獲取目的基因，同時(shí)也完成了基因在體外的克隆，成為分子生物學(xué)及基因工程中的研究手段。另外在醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療診斷中亦體現(xiàn)出應(yīng)用價(jià)值。

 

　　PCR的反應(yīng)條件與很多參數(shù)有關(guān)系。如模板濃度，引物長(zhǎng)度及GC含量，引物濃度，dNTPs濃度，緩沖液的離子含量，產(chǎn)物大小，變性時(shí)間，退火溫度及時(shí)間，延長(zhǎng)的時(shí)間。

 

　　物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。

 

　　有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

 

　　如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

 

　　靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。