皖儀科技液相色譜測(cè)定藥品中有效成分含量

返魂草為我國(guó)長(zhǎng)白山地區(qū)的特色資源之一，收載于中國(guó)藥典2020年版第四部“成方制劑中本版藥典未收載的藥材和飲片"，為菊科千里光屬植物的干燥全草，包括全葉千里光和麻葉千里光 ,具有清熱化痰、鎮(zhèn)咳平喘功效 ,其主要活性成分是以綠原酸為代表的有機(jī)酸類和以金絲桃苷為代表的黃酮類。祛風(fēng)止痛膠囊是由老鸛草、槲寄生、續(xù)斷等藥材組成的中藥復(fù)方制劑，該藥具有祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、舒筋活血、強(qiáng)壯筋骨的功效,用于四肢麻木、腰膝疼痛、風(fēng)寒濕痹等癥。處方中續(xù)斷具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏、安胎等功效,其有效成分為川續(xù)斷皂苷Ⅵ。

本文采用高效液相色譜法分別對(duì)返魂草中綠原酸、金絲桃苷含量以及祛風(fēng)止痛丸中續(xù)斷的有效成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量進(jìn)行測(cè)定,均取得滿意效果。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器配置

          表1. 高效液相色譜系統(tǒng)配置清單

1.2 試劑及實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 返魂草

乙腈：色譜純；

甲醇：色譜純；

綠原酸（標(biāo)準(zhǔn)品）：(100μg/mL in Methanol)；

金絲桃苷（標(biāo)準(zhǔn)品）：(98.0%)；

一次性注射器（0.5-2mL）；

微孔濾膜（0.45μm）；

1.2.2 祛風(fēng)止痛丸

乙腈：色譜純；

甲醇：色譜純；

正丁醇：分析純；

氨水：優(yōu)級(jí)純；

川續(xù)斷皂苷Ⅵ（標(biāo)準(zhǔn)品）：(98.0%）；

1.3 測(cè)試條件

1.3.1 返魂草

色譜柱：C18 5μm, 4.6×250mm；

柱溫：35℃；

流速：1mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；

進(jìn)樣方式及進(jìn)樣量：自動(dòng)部分10μL進(jìn)樣；

流動(dòng)相：A：乙腈 B：0.2%甲醇溶液；

        表2. 返魂草流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.3.2 祛風(fēng)止痛丸

色譜柱：C18 5μm, 4.6×250mm；

柱溫：35℃；

流速：1mL/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：212nm；

進(jìn)樣方式及進(jìn)樣量：自動(dòng)部分10μL進(jìn)樣；

流動(dòng)相：乙腈-水=30:70；

1.4 溶液配制

1.4.1 返魂草

1.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

①精確量取標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸（100μg/mL）600μl，加甲醇制成每1mL含綠原酸60μg的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

②精密稱定標(biāo)準(zhǔn)品金絲桃苷（98.0%）0.0042g，用甲醇定容至100mL容量瓶中制成40μg/mL的金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.4.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別量取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各500uL，混勻，即可配制成每1mL含綠原酸30μg、金絲桃苷20μg的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.1.3 供試品溶液

取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩）0.2506g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液20mL,密塞，稱定重量，超聲處理（250W，頻率40KHz）60分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.4.2 祛風(fēng)止痛丸

1.4.2.1 水飽和的正丁醇

在分液漏斗里面倒入適量的水和正丁醇，振搖提取數(shù)分鐘，放置分層后，先將下層的水（水的密度較正丁醇大）從漏斗中緩慢放出，余下者即為水飽和正丁醇。

1.4.2.2 氨試液

取濃氨溶液60mL，加水使成150mL，即得。

1.4.2.3 正丁醇飽和的水

在水中加入足量的正丁醇，混合均勻，然后靜置分層，取水使用。

1.4.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品0.0052g，精密稱定，置于25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即制成每1mL含0.2mg的溶液。

1.4.2.5 供試品溶液

取祛風(fēng)止痛丸適量，研細(xì)，取1.9998g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL,密塞，稱定重量，超聲處理（250W，頻率50KHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘?jiān)铀?span>25mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次（50mL，30mL,30mL），合并正丁醇提取液，用氨試液100mL洗滌，再用正丁醇飽和的水100mL洗滌，取正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25mL用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠原酸、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)

         圖1. 綠原酸、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

           表3. 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜參數(shù)

          表4. 金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜參數(shù)

2.2返魂草樣品檢測(cè)

               圖2 返魂草色譜圖

           表5. 返魂草綠原酸色譜參數(shù)

           表6. 返魂草金絲桃苷色譜參數(shù)

說(shuō)明：據(jù)返魂草色譜圖可見(jiàn)樣品綠原酸、金絲桃苷分離效果、重復(fù)性較好，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算返魂草中含綠原酸（C16H18O9）為0.25%，含金絲桃苷（C21H20O12）為0.127%。

2.3川續(xù)斷皂苷Ⅵ標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)

         圖3. 川續(xù)斷皂苷Ⅵ標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

  表7. 川續(xù)斷皂苷Ⅵ標(biāo)準(zhǔn)品色譜參數(shù)2.4祛風(fēng)止痛丸樣品檢測(cè)

            圖4. 祛風(fēng)止痛丸色譜圖

            表8. 祛風(fēng)止痛丸色譜參數(shù)

說(shuō)明：據(jù)色譜圖可見(jiàn)祛風(fēng)止痛丸樣品、川續(xù)斷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性較好，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ（C47H76O18）計(jì)，祛風(fēng)止痛丸中每1g含續(xù)斷6.35mg。

3 結(jié)論

據(jù)吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)DBY-22-JLYC-001-2017，返魂草樣品含量測(cè)定按干燥品計(jì)算，含綠原酸（C16H18O9）不得少于0.10%，金絲桃苷（C21H20O12）不得少于0.050%。使用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器測(cè)得返魂草樣品中含綠原酸（C16H18O9）為0.25%，含金絲桃苷（C21H20O12）為0.127%，返魂草樣品中綠原酸（C16H18O9）的定性RSD（%）為0.355%，定量RSD（%）為0.491%。樣品中金絲桃苷（C21H20O12）的定性RSD（%）為0.399%，定量RSD（%）為0.403%，均符合標(biāo)準(zhǔn)。

據(jù)《中國(guó)藥典》，祛風(fēng)止痛丸樣品含量測(cè)定按每1g含續(xù)斷以川續(xù)斷皂苷VI（C47H76O18）計(jì)，不得少于4.30mg。使用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器測(cè)得祛風(fēng)止痛丸樣品中以川續(xù)斷皂苷Ⅵ（C47H76O18）計(jì)每1g含續(xù)斷6.35mg，祛風(fēng)止痛丸樣品中川續(xù)斷皂苷VI（C47H76O18）的定性RSD（%）為0.331%，定量RSD（%）為0.663%，符合標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器測(cè)定返魂草和祛風(fēng)止痛丸中有效成分含量，分離效果和重復(fù)性較好，能夠很好地滿足《中國(guó)藥典》和吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)DBY-22-JLYC-001-2017的測(cè)試要求。