細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存操作流程

儀器與試劑

護(hù)目鏡、厚毛線手套等

操作流程

復(fù)蘇

1）將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到 37℃；

2

）準(zhǔn)備一支 15ml 離心管，加入 5ml 含 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基，放入 37℃水浴鍋中預(yù)熱；

3

）戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入 37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動(dòng)凍存管以提高復(fù)溫速率；

4

）將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)中，混勻后，1000rpm 離心 5min；

5

注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。

傳代

（細(xì)胞傳代建議一傳二）

1.

當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 85%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代。

2.

在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基；

3.

向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入 3ml 無(wú)菌的 1×PBS  后，水平放置培養(yǎng)瓶，使 PBS 能夠浸潤(rùn)到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄 PBS；

4.

凍存

（細(xì)胞凍存建議每瓶 T25 凍一支）

1~6

）參照傳代步驟

7）離心完成后，棄上清，用 1mL 凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入 1.8ml 凍存管中；

8）將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過夜降溫；

9）第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。