脂肪酸合成酶（FAS）活性試劑盒說明書

微量法100T/96S

注  意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

FAS 是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶 /A 和丙二酰輔酶/ A 而生成長鏈脂肪酸。FAS 普遍表達于各種組織細胞中，在哺乳動物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達豐富。

測定原理：

FAS 催化乙酰 CoA、丙二酰 CoA 和 NADPH 生成長鏈脂肪酸和 NADP⁺；NADPH 在 340nm 有吸收峰，而 NADP⁺沒有；通過測定 340nm 光吸收下降速率，計算 FAS 活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 100mL×1 瓶，－20℃保存。用前 1d 取出置于 4℃充分解凍后混勻。

試劑二：粉劑×1 瓶。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體 20mL×1 瓶, 4℃保存。

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 840μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

粗酶液提?。?/span>

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 40min，取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 12000g，4℃，離心 40min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

FAS 測定操作：

1.    分光光度計/酶標儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.    試劑四置于 40℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3.     在 96 孔板或 EP 管中依次加入 20μL 上清液、4μL 試劑二、4μL 試劑三、164μL 試劑四和 8μL 試劑五，混勻后于 340nm 處測定吸光值，記錄第 30s 和 90s 時吸光值，分別記錄為 A1

和 A2。△ A 測=A1-A2。

FAS 活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個酶活單位。 FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(Cpr×V 樣)÷T

=1608×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個酶活單位。

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =1608×△A ÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃中每 10⁴ 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個酶活單位。

FAS(nmol /min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T =1608×△A ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個酶活單位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷V 樣÷T =1608×△A

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系

總體積，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入

反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1min。

b.使用 96 孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個酶活單位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷(Cpr×V 樣)÷T =3216×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個酶活單位。

⁹

=3216×△A÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃中每 10⁴ 個細胞每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個酶活單位。

FAS(nmol /min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T =3216×△A÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個酶活單位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹ )÷V 樣÷T =3216×△A

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V 樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1min。

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