熒光成像 失敗原因與成功訣竅

要點(diǎn)1：確認(rèn)使用的物鏡是否合適

要進(jìn)行顯微鏡觀察必須了解觀察目的與物鏡特性是否相符。尤其在熒光觀察中重要的是數(shù)值孔徑（NA），數(shù)值孔徑越大，越能獲取明亮，正常情況下，數(shù)值孔徑越大分辨率也越高，可獲取精細(xì)的圖像，但在另一方面，景深（Depth of Field：DOF）則變淺，被攝物體的可視對(duì)焦范圍變窄。除此以外，物鏡亮度或觀察距離也需要考慮，這些特性間的相關(guān)關(guān)系如下圖所示。

另外還有需要蓋板玻璃校正^*1及校正環(huán)調(diào)整^*2的物鏡、專用于特殊觀察方法的光學(xué)設(shè)計(jì)物鏡等各種各具特點(diǎn)的物鏡^*3。根據(jù)觀察方法選擇合適的物鏡尤為重要。

*1 蓋板玻璃校正：
蓋板玻璃校正物鏡設(shè)有蓋板玻璃校正值。正常情況下，蓋板玻璃使用0.17 mm，塑料培養(yǎng)皿為1.2 mm，不使用蓋板玻璃時(shí)使用0 mm物鏡。

*2 校正環(huán)調(diào)整：
高倍率物鏡中還有外殼部分帶有校正環(huán)（類似表盤）的部件。根據(jù)蓋板玻璃的厚度調(diào)整校正環(huán)，分辨率可變化數(shù)倍，使用前請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)校正環(huán)的狀態(tài)。

*3 物鏡的特點(diǎn)：
按照觀察方法，有時(shí)需要符合觀察方法的特定光學(xué)設(shè)計(jì)物鏡。包括相差、微分干涉、偏光、熒光、油鏡等。請(qǐng)確認(rèn)物鏡種類。

要點(diǎn)2：從低倍率向高倍率調(diào)整物鏡

要點(diǎn)3：由近及遠(yuǎn)查找焦點(diǎn)位置

要點(diǎn)1：使用適合觀察的相機(jī)

相機(jī)也有很多種類，下面介紹廣泛用于熒光顯微鏡的CCD相機(jī)的特點(diǎn)。
熒光觀察中重要的是S/N比（信號(hào)與干擾的比率）足夠高，因此在下表中合適的是黑白制冷CCD相機(jī)。

*1 可見光：
一般是指波長(zhǎng)大約為400至700 nm的光。彩色相機(jī)的顯示與人眼相同，會(huì)切斷波長(zhǎng)長(zhǎng)度700 nm以上的光。因此無法觀察。

*2 暗電流和制冷：
CCD相機(jī)內(nèi)部在沒有輸入光的狀態(tài)下也會(huì)產(chǎn)生叫作“暗電流"的信號(hào)，是造成干擾的原因。曝光時(shí)間越長(zhǎng)受光元件的溫度越高，干擾也變大，通過冷卻相機(jī)可抑制干擾。

要點(diǎn)2：使用調(diào)節(jié)亮度功能

亮度調(diào)節(jié)功能有多種，在相機(jī)設(shè)定中主要的調(diào)節(jié)方式是以下3個(gè)項(xiàng)目。理解這些特點(diǎn)并熟練地區(qū)分使用對(duì)熒光成像非常重要。

• 曝光時(shí)間

• 快門處于開啟的時(shí)間。為在此期間積蓄信號(hào)，曝光時(shí)間越長(zhǎng)亮度越高，同時(shí)暗電流干擾也會(huì)累積從而干擾增多。

• 增益

• 對(duì)輸入CCD元件的電信號(hào)進(jìn)行電性放大。但是，放大輸入信號(hào)后，干擾也會(huì)同時(shí)被放大。分辨率不因增益值而變化。

• Binning（像素融合）

• 將臨近的像素視為1個(gè)假想像素，提高每個(gè)單位像素的接收信號(hào)量的功能。由于像素被合并圖片整體的像素?cái)?shù)減少，分辨率將下降，但不會(huì)增加干擾。

要點(diǎn)3：熒光濾光片與試劑的匹配

即使熒光信號(hào)明亮而發(fā)光，如果濾光片透過率過低，仍無法充分觀察信號(hào)。重要的是盡量使用透過率高的濾光片。
熒光濾光片由激發(fā)濾光片與吸收濾光片、二向色鏡共3部分組成。確認(rèn)激發(fā)濾光片是否與試劑的激發(fā)光譜重疊，吸收濾光片是否與試劑的熒光光譜重疊。假設(shè)加入濾光片上標(biāo)注470/40時(shí)，表示可涵蓋470nm±20nm的波長(zhǎng)范圍。數(shù)值數(shù)據(jù)難以理解時(shí)，觀察試劑與濾光片的光譜數(shù)據(jù)來判斷是否匹配。各種試劑或?yàn)V光片的光譜數(shù)據(jù)可通過各廠商的網(wǎng)站等確認(rèn)。

要點(diǎn)4：物鏡的選擇

熒光信號(hào)偏弱，或?qū)Ρ榷炔蛔銜r(shí)，可通過更換NA值更大的物鏡，以便更明亮地觀察。 NA值越大，越能夠明亮地觀察熒光信號(hào)。物鏡的倍率越高，NA值也趨于變大，S/N比的上升不夠理想時(shí)，通過使用倍率更高的物鏡也可解決問題。

要點(diǎn)5：光源的選擇

有些光源沒有發(fā)出要觀察的波長(zhǎng)。需要確認(rèn)使用的光源，了解光源的特點(diǎn)并區(qū)分使用。
相比于水銀燈或金鹵燈是1種光源包含短波長(zhǎng)到長(zhǎng)波長(zhǎng)的大范圍波長(zhǎng)，激光或LED是1種光源只發(fā)出特定范圍的波長(zhǎng)，因此需要將多個(gè)光源組合使用。信號(hào)無法順利發(fā)光時(shí)，確認(rèn)試劑與光源波長(zhǎng)的光譜數(shù)據(jù)。

要點(diǎn)1：激發(fā)光強(qiáng)度下降

降低激發(fā)光強(qiáng)度，熒光就會(huì)相應(yīng)地變暗，因此需要提高相機(jī)增益或延長(zhǎng)曝光時(shí)間。但是，提高增益或延長(zhǎng)曝光時(shí)間，就會(huì)增大暗電流的干擾，S/N比變低。
要在抑制淬滅及損傷的同時(shí)拍攝S/N比高的圖像，需要盡量使用靈敏度高的相機(jī)。

要點(diǎn)2：縮短激發(fā)光照射時(shí)間

要縮短激發(fā)光照射時(shí)間，需要降低基本的操作時(shí)間，因此盡量縮短對(duì)焦時(shí)間、信號(hào)查找所用的時(shí)間、設(shè)定曝光時(shí)間所用的時(shí)間等操作所用的時(shí)間。
另外，對(duì)于手動(dòng)控制激發(fā)光快門開閉的顯微鏡類型，可能發(fā)生忘記關(guān)快門而造成長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)照射激發(fā)光，導(dǎo)致淬滅。因此拍攝結(jié)束后或臨時(shí)停止觀察時(shí)，及時(shí)關(guān)閉快門尤為重要。