慢病毒包裝實驗

慢病毒（Lentivirus）載體是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 1 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。慢病毒具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細胞、長期穩(wěn)定表達外源基因等優(yōu)點，因此成為導(dǎo)入外源基因的有力工具。現(xiàn)在慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細胞系的基因過表達、RNA 干擾、microRNA 研究以及活體動物實驗中。

一、實驗流程

圖  1、 慢病毒包裝實驗流程圖

二、實驗儀器與實驗材料

psPAX2 質(zhì)粒，pMD2.G 質(zhì)粒，pHBLVTM 系列質(zhì)粒；293T 細胞；wan全培養(yǎng)基；DH5α 菌株；Stbl3 菌株。

三、實驗步驟

1. 質(zhì)粒擴增。將構(gòu)建好的慢病毒載體和包裝質(zhì)粒使用大抽試劑盒進行質(zhì)粒的去內(nèi)毒素抽提，濃度建議不低于 1 μg/μl，A260/280 在 1.7-1.8 間方可用于病毒包裝。推薦使用 Qiagen 大抽試劑盒進行質(zhì)粒的大量去內(nèi)毒素抽提（質(zhì)粒質(zhì)量會極大影響后續(xù)轉(zhuǎn)染效率和病毒的滴度）。

2. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，在10 cm皿中接種生長狀態(tài)良好的293T細胞，以第二天匯合度能達到 30% ~ 50% 為宜。24 h 后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前需要把 DMEM 和慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑 LentiFitTM 恢復(fù)至室溫，使用前需搖勻。每個皿的質(zhì)粒成分如下：

表 1、慢病毒包裝轉(zhuǎn)染體系

用于包裝的三個質(zhì)粒摩爾比通常為 1:1:1，可以根據(jù)情況稍加調(diào)整。請參考 LentiFitTM 轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后 4-6 h 換新鮮培養(yǎng)基。

3. 病毒收集和離心。轉(zhuǎn)染后 48 h 和 72 h 分別兩次收集病毒上清（48 h 收集后置換新鮮培液）， 將收集的上清用 0.45 μm 濾器過濾，然后放于超速離心管中，4 ℃，72000 g 離心 120 min。

4. 病毒重懸和保存。棄上清，500 μl 重懸液重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于 4 ℃ 保存，如需長時間存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。（注：具體重懸體積根據(jù)實驗需求而定）

5. 滴度測定。在 96 孔板中鋪合適數(shù)量的 293T 細胞，第二天將慢病毒原液進行梯度稀釋后分別感染 293T 細胞，感染 24 h 后換成無病毒的培養(yǎng)液，感染 72 h 后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，對熒光比例合適（10 ~ 30% 之間）的孔進行細胞計數(shù)。

滴度計算公式為：滴度（TU/ml）=細胞數(shù) ×熒光百分比×10 3 / 病毒原液體積

四、注意事項

1. 慢病毒相關(guān)實驗請在生物安全柜（BL-2 級別）內(nèi)操作。

2. 操作病毒時請穿實驗服，佩戴口罩和手套，盡量不要裸露雙手及手臂的皮膚。

3. 操作病毒時特別小心病毒濺出。如果操作時超凈工作臺有bing毒污染，請立即用 70% 乙醇加 1% 的 SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液請于 84 消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。

4. 如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管， 如有必要請用封口膜封口后離心。

5. 病毒相關(guān)的廢棄物需要特殊收集，統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理。

6. 實驗完畢用香皂清洗雙手。

五、常見問題

1. 影響慢病毒出毒及滴度的原因有哪些？

（1）質(zhì)粒。包毒前需要對包裝及表達質(zhì)粒進行去內(nèi)毒素處理，濃度建議不低于 1μg/μl，A260/280 在 1.7-1.8 間；

（2）轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒比例。要用轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性小的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒間比例得當，建議三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時的摩爾比為 1:1:1 可根據(jù)目的基因大小進行調(diào)整；

（3）目的基因。一般慢病毒包裝的目的片段大小在 3 k 以內(nèi)較為合適，大于 3 k 會降低滴度或超過載體容量無法包裝、目的基因本身是否具有毒性也會影響慢病毒的出毒效率；

（4）包裝細胞 -293T 細胞的狀態(tài)。細胞出毒過程中的細胞活力是包裝成功及病毒滴度高低的一個重要環(huán)節(jié)，進行包裝轉(zhuǎn)染 293T 細胞前一定要重視細胞是否干凈、飽滿立體感是否好、鋪板是否均勻，細胞密度在 50-60% 時進行包裝比較合適；

（5）病毒收集：在 24、48 h 觀察細胞及熒光狀態(tài)，判斷是否正常，轉(zhuǎn)染后 48 h 和 72 h 分別兩次收集病毒上清（48 h 收集后置換新鮮培液）。

2. 該如何選擇合適的慢病毒包裝質(zhì)粒？

慢病毒常用的包裝系統(tǒng)是二代三質(zhì)粒系統(tǒng)，骨架質(zhì)粒 pSPAX2 和包膜質(zhì)粒 pMD2.G 是明確的包裝質(zhì)粒。目的基因的表達質(zhì)粒需要根據(jù)實驗需求進行選擇，主要包括啟動子、標簽蛋白、熒光和抗性等元件。

（1）目的基因的過表達通常選擇 CMV/EF1a 啟動子，目的基因的干擾通常選擇U6 啟動子；

（2）若需要穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選，則需攜帶 PURO/BSD/NEO 等抗性篩選基因；

（3）后續(xù)需要觀察慢病毒感染效率一般需要攜帶 EGFP/mCherry 等熒光蛋白便于通過顯微鏡直觀監(jiān)測感染效率；

（4）標簽蛋白的選擇可以根據(jù)不同的實驗需求進行選擇，如純化蛋白常使用 His 標簽，CO-IP 常使用 Flag/HA/Myc 標簽，PULLDOWN 常使用 GST 標簽等。

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