免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)是一種綜合定性、定位和定量；形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測技術(shù)。在原位檢測出病原的同時(shí)，還能觀察到組織病變與該病原的關(guān)系，確認(rèn)受染細(xì)胞類型，從而有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和病理過程。那么你知道免疫組化實(shí)驗(yàn)常見問題有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、石蠟切片再染色過程出現(xiàn)脫片現(xiàn)象

1. 烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時(shí)間和提高烤片溫度；

2. 用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；

3. 有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

4. 用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。

二、邊緣效應(yīng)

1. 組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2. 切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。

三、產(chǎn)生組織切片非特異性染色

1. 抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條；

2. 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

3. 內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4. 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；

5. DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高；

6. PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

7. 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

四、免疫組化染色呈陰性結(jié)果

1. 抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤；

2. 抗原修復(fù)不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；

3. 組織切片本身這種抗原含量低；

4. 血清封閉時(shí)間過長；

5. DAB孵育時(shí)間過短；

6. 細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)；

7. 開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

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