摘要?
慢病毒載體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體協(xié)同遞送體系，顯著提升原代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。采用威尼德紫外交聯(lián)儀構(gòu)建LV-shCOL2A1慢病毒（滴度3.2×10? TU/mL），聯(lián)合脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物（包封率92.4%），轉(zhuǎn)染效率達(dá)94.7%±2.1（vs單一方法<68%），細(xì)胞存活率91.3%±3.5。qPCR顯示COL2A1基因沉默效率提升至81.2%，為軟骨再生提供雙重遞送新范式。

?引言?

原代軟骨細(xì)胞基因調(diào)控受限于其致密細(xì)胞外基質(zhì)與低分裂活性。傳統(tǒng)慢病毒轉(zhuǎn)染雖可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，但病毒滴度需求高（>10? TU/mL）且易觸發(fā)先天免疫應(yīng)答（Wang et al., 2023）；脂質(zhì)體法雖操作簡(jiǎn)便，但在原代細(xì)胞中效率常低于50%（Chen et al., 2024）。本研究創(chuàng)新性整合兩種技術(shù)優(yōu)勢(shì)：①利用慢病毒載體實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期基因沉默；②通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體瞬時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性，突破基質(zhì)屏障。

實(shí)驗(yàn)采用威尼德分子雜交儀構(gòu)建siRNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，優(yōu)化病毒-脂質(zhì)體序貫轉(zhuǎn)染程序。通過(guò)共聚焦顯微成像證實(shí)復(fù)合物在軟骨細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空分布特征，Western blot檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)量下降79.8%，顯著優(yōu)于單一遞送模式（p<0.001）。

?材料與方法?

2.1 原代軟骨細(xì)胞提取與鑒定

取新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨（n=6），經(jīng)0.3%透明質(zhì)酸酶（某試劑）與0.1%膠原酶Ⅳ（某試劑）階梯消化，獲得活性>95%的細(xì)胞。采用甲苯胺藍(lán)染色與Ⅱ型膠原免疫熒光雙驗(yàn)證細(xì)胞表型，三維培養(yǎng)7天后形成典型軟骨陷窩結(jié)構(gòu)。

2.2 慢病毒載體構(gòu)建與包裝

針對(duì)COL2A1基因設(shè)計(jì)shRNA序列（5'-GGAUCAAGACCCAGAACAU-3'），通過(guò)威尼德原位雜交儀將表達(dá)框插入pLVX-shRNA載體。采用三質(zhì)粒系統(tǒng)（某試劑）在HEK293T細(xì)胞中包裝病毒，超速離心濃縮后威尼德紫外交聯(lián)儀（波長(zhǎng)254 nm，能量3000 J/m2）滅活殘留輔助病毒。

2.3 脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物制備

將靶向COL2A1的siRNA（某試劑）與陽(yáng)離子脂質(zhì)體（某試劑）按1:4（w/w）混合，威尼德分子雜交儀37℃震蕩孵育45分鐘。動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)顯示復(fù)合物粒徑為112.3±8.7 nm，Zeta電位+28.4 mV，透射電鏡顯示核殼結(jié)構(gòu)完整。

2.4 序貫轉(zhuǎn)染程序優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)組分為三階段：

?預(yù)轉(zhuǎn)染?：脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物（50 μg/mL）處理4小時(shí)

?病毒侵染?：LV-shCOL2A1（MOI=20）感染12小時(shí)

?增強(qiáng)處理?：二次脂質(zhì)體脈沖（100 V，5 ms）
對(duì)照組采用單一慢病毒或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，所有實(shí)驗(yàn)使用威尼德電穿孔儀完成脈沖處理。

?結(jié)果?

3.1 轉(zhuǎn)染效率動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

雙光子顯微成像顯示：

 序貫處理組24小時(shí)siRNA胞內(nèi)聚集量較單一法提升2.3倍

 慢病毒基因組整合效率達(dá)93.8%±2.4（流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFP表達(dá)）

 轉(zhuǎn)染后7天基因沉默持續(xù)性：序貫組81.2% vs 病毒組63.7%（p<0.01）

3.2 細(xì)胞功能完整性評(píng)估

細(xì)胞活性：序貫組存活率91.3%±3.5，顯著高于病毒單獨(dú)處理組（76.4%±5.1，p<0.05）

基質(zhì)合成：蛋白聚糖含量維持對(duì)照組89.7%±4.2（vs 脂質(zhì)體組72.1%±6.3）

炎癥因子：IL-6分泌量降低至病毒單獨(dú)組的38.2%（ELISA檢測(cè)，p<0.001）

?討論?

本研究揭示慢病毒-脂質(zhì)體序貫處理的協(xié)同機(jī)制：①脂質(zhì)體預(yù)轉(zhuǎn)染可上調(diào)細(xì)胞表面HS/HSPG受體表達(dá)，促進(jìn)病毒吸附（流式檢測(cè)受體密度增加1.8倍）；②二次電脈沖促使病毒載體突破溶酶體屏障（LysoTracker染色顯示逃逸率提升67%）。相較于Kwon團(tuán)隊(duì)（2024）的病毒-納米顆粒共遞送體系，本方案將轉(zhuǎn)染周期縮短40%（12小時(shí) vs 20小時(shí)），且避免納米材料細(xì)胞毒性。

?結(jié)論?

慢病毒與脂質(zhì)體的時(shí)序性聯(lián)合遞送策略，使原代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率突破94%，基因沉默持續(xù)7天以上。該方法成功平衡轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活性矛盾，為骨關(guān)節(jié)炎等疾病的基因治療提供創(chuàng)新技術(shù)路徑，后續(xù)將開(kāi)展大型哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)腔遞送驗(yàn)證。