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細(xì)胞復(fù)蘇和凍存是細(xì)胞培養(yǎng)中常見的操作,主要用于保存和恢復(fù)細(xì)胞系。以下是一些基本的步驟和注意事項:
### 細(xì)胞凍存(Cryopreservation)
1. **細(xì)胞準(zhǔn)備**:選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,通過胰蛋白酶或EDTA等消化細(xì)胞,使其成為單個細(xì)胞懸液。
2. **細(xì)胞計數(shù)**:使用細(xì)胞計數(shù)器確定細(xì)胞密度。
3. **加入凍存液**:將細(xì)胞懸液與凍存液按一定比例混合,常用的凍存液含有DMSO或丙三醇等作為保護劑。
4. **分配細(xì)胞**:將細(xì)胞懸液分配到凍存管中,通常每管的細(xì)胞量是1-2mL。
5. **逐步降溫**:
- 短期保存:可以立即將凍存管放入-80°C冰箱或液氮罐中的凍存盒中。
- 長期保存:通常采用程序降溫機進行逐步降溫,以防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成,造成損傷。
6. **儲存**:將凍存管存放在液氮罐中,溫度約為-196°C。
### 細(xì)胞復(fù)蘇(Thawing)
1. **準(zhǔn)備**:從液氮罐中取出所需的凍存管,快速轉(zhuǎn)移至37°C水浴中。
2. **解凍**:在水浴中輕輕搖動凍存管,直到冰wan全融化。
3. **去除凍存液**:將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有wan全培養(yǎng)基的離心管中,輕輕混合。
4. **離心**:通常以低速(約100-200g)離心5-10分鐘,以沉淀細(xì)胞。
5. **去除上清**:小心去除上清液,避免擾動細(xì)胞沉淀。
6. **重懸和接種**:將細(xì)胞重懸于適量的wan全培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中進行培養(yǎng)。
### 注意事項
- **無菌操作**:整個過程需在無菌條件下進行,避免污染。
- **凍存液的選擇**:不同細(xì)胞類型可能需要不同的凍存液配方。
- **細(xì)胞密度**:凍存時細(xì)胞密度不宜過高,以免影響復(fù)蘇后的細(xì)胞活性。
- **解凍速度**:快速解凍有助于減少細(xì)胞損傷。
- **復(fù)蘇后的監(jiān)測**:復(fù)蘇后需檢查細(xì)胞生長狀態(tài)和污染情況。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的成功與否直接關(guān)系到細(xì)胞系的質(zhì)量和長期使用的可行性,因此這些操作需要嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。
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