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一、己烯雌酚檢測(cè)試劑盒概要
己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)是甾類同化激素,被大量用于促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)。但由于己烯雌酚存在明顯的致癌性,歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已相繼禁止或嚴(yán)格禁止使用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中規(guī)定,動(dòng)物源性食品中己烯雌酚的殘留xian量為不得檢出。
二、己烯雌酚檢測(cè)試劑盒原理
己烯雌酚試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)尿樣、組織、飼料等樣本中的己烯雌酚,試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的己烯雌酚和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗己烯雌酚抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含己烯雌酚含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中己烯雌酚的殘留量。
三、適用范圍
己烯雌酚試劑盒可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織(肌肉、肝臟等)、尿液、飼料等樣品中己烯雌酚的殘留量。
四、 技術(shù)指標(biāo)
1 試劑盒靈敏度:0.1ppb(ng/ml)
2 反應(yīng)模式:37℃,30min~30min~15min。
3 檢測(cè)下限:
組織(蝦、魚):0.2ppb
豬肉/肝、雞肉/肝:2ppb
飼料:……20ppb
尿液:……0.6ppb
4 交叉反應(yīng)率:
己烯雌酚:100%
雙烯雌酚:38.5%
己烷雌酚:8.5%
己炔雌二醇:<0.1%
雌三醇:…<0.1%
5 樣本回收率:
尿 樣 : 70%±10%
組 織 : 85%±10%
飼 料 : 90%±10%
五試劑盒組成
酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、高標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物、抗體工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮洗滌液、復(fù)溶液
六、貯藏條件及保存期
儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,不要冷凍。
保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。
酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
1 編 號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加抗體工作液50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光反應(yīng)30分鐘。
3 洗 滌:小心揭開(kāi)蓋板膜,甩去孔內(nèi)液體,每孔加350ul工作洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)洗滌5次,最后一次拍干(用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
4 加酶反應(yīng):加酶標(biāo)記物100µl/孔,25℃避光反應(yīng)30分鐘。
5 洗 滌:同上
6 顯 色:加底物液A 50µl/孔,再加底物液B 50µl/孔,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘(若藍(lán)色過(guò)淺,可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間)。
7 終 止:加終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。
8 測(cè)吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm)。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
結(jié)果分析
1 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)=A×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。