細(xì)胞線粒體分離試劑盒

MCE 國際站：Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲(chǔ)條件： -20oC 保存一年。

簡介：MCE 細(xì)胞線粒體分離試劑盒可快速分離所培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體，且線粒體純度較高，絕大多數(shù)具有完整的內(nèi)外膜及生理功能。

概述：線粒體是真核細(xì)胞中產(chǎn)生能量的主要部位，具有雙層膜結(jié)構(gòu)。制備線粒體的關(guān)鍵在于確保線粒體的完整性和純度。通常先低速離心去除細(xì)胞核及細(xì)胞碎片，再高速離心獲得線粒體。MCE 細(xì)胞線粒體分離試劑盒可快速分離所培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體，且線粒體純度較高，絕大多數(shù)具有完整的內(nèi)外膜及生理功能。提取的線粒體也可被相應(yīng)裂解液裂解后得到線粒體蛋白，用于 SDS-PAGE、WB、雙向電泳等蛋白分析。此外，本試劑盒也可用于提取不含線粒體的細(xì)胞漿蛋白。本試劑盒可檢測(cè)50-100 個(gè)樣品，建議每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量為 2-5×107 個(gè)。

描述：

線粒體是真核細(xì)胞中大部分能量產(chǎn)生的場(chǎng)所，具有雙層膜結(jié)構(gòu)：外膜和折疊的內(nèi)膜。線粒體的制備關(guān)鍵是確保線粒體的完整性和純度。

MCE培養(yǎng)細(xì)胞線粒體分離試劑盒采用差速離心法，可快速高效地從細(xì)胞中分離線粒體。分離出的線粒體大部分具有完整的內(nèi)外膜，并具有生理功能。此外，該試劑盒還可用于提取線粒體蛋白和不含線粒體的胞質(zhì)蛋白。該試劑盒含有足夠的試劑，可從2-5×107個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行50-100次分離程序。

操作說明：1. 從 -20oC 冰箱中取出各試劑，室溫解凍，置于冰上備用。2. 將 1.5 mL PMSF (solvent) 加入 PMSF (crystal) 中，充分溶解，即得 1.5 mL 100 mM PMSF 溶液3. 提前接種細(xì)胞，至細(xì)胞密度達(dá)到 70-90%。4. 收集細(xì)胞貼壁細(xì)胞：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入 PBS 洗滌一次。加入 Trypsin Buffer 消化細(xì)胞，100-200 g，4oC 離心 5-10 分鐘懸浮細(xì)胞：100-200 g，4oC 離心 5-10 分鐘收集細(xì)胞注：Trypsin Buffer 本試劑盒未提供，需另行購買。5. 加入預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞，600 g，4oC 離心 5 分鐘，棄去上清。6. 每 2-5×107 個(gè)細(xì)胞中加入 1-2.5 mL Mitochondria Isolation Reagent(含 1 mM PMSF)，輕輕重懸細(xì)胞，冰浴 10-15 分鐘。7. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至勻漿器中，勻漿 10-30 下。注：a. 需根據(jù)細(xì)胞類型及勻漿器類型自行優(yōu)化勻漿次數(shù)。b. 可在勻漿 10 次后取 2 μL 細(xì)胞勻漿，加入 30-50 μL Trypan Blue 染色鑒定勻漿效果。若陽性細(xì)胞（藍(lán)色）比例不足 80%，增加 5 次勻漿并用 Trypan Blue 染色鑒定，直至陽性比例超過 80%。c. 請(qǐng)勿過度勻漿，防止線粒體損傷。8. 將細(xì)胞勻漿 600 g，4oC 離心 10 分鐘。注：此步離心目的在于去除細(xì)胞核、細(xì)胞碎片及未裂解細(xì)胞。將離心速度提升至 1,000 g 可獲得更純的線粒體，但線粒體抽提率相對(duì)下降。9. 將上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，11,000 g，4oC 離心 10 分鐘。注：此步離心目的在于沉淀線粒體。將離心速度改為 3,500 g 可獲得更純的線粒體，但線粒體抽提率相對(duì)下降。10. 棄去上清，所得沉淀即為細(xì)胞線粒體。注：此步驟也可用于獲得不含線粒體的細(xì)胞漿蛋白。收集本步驟中的上清，12,000 g，4oC 離心 10 分鐘，獲得的上清液即為不含線粒體的細(xì)胞漿蛋白。后續(xù)可用 BCA 法或 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。11. 線粒體的應(yīng)用a. 完整線粒體的功能及酶活研究：每 2-5×107 個(gè)細(xì)胞分離得到的線粒體中加入 150-200 μL Mitochondria Storage Buffer，重懸備用。后續(xù)可使用 MCE 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（Cat. No.: HY-K0601）測(cè)定分離得到的線粒體的膜電位。b. 線粒體蛋白分析：每 2-5×107個(gè)細(xì)胞分離得到的線粒體中加入 150-200 μL 臨用前添加了 PMSF 的 Mitochondria Lysis Buffer（PMSF 終濃度為 裂解后得到的線粒體蛋白經(jīng) 12,000g，4oC，離心 3-5 min 后可用于 PAGE、WB、IP 及酶活測(cè)定，也可用 BCA 法或 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。

注意事項(xiàng)：1. 若要制備線粒體蛋白樣品，需在Mitochondria Isolation Reagent 和 Mitochondria Lysis Buffer 中加入 PMSF，且 PMSF 一定要在試劑加入樣品前1-2 min 內(nèi)加入，防止 PMSF 失效。2. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)在冰上或 4oC 進(jìn)行。所用溶液需冰浴或 4oC 預(yù)冷。3. 本實(shí)驗(yàn)獲得的線粒體樣品若不能及時(shí)使用，建議 -80oC 保存。凍存后的線粒體不建議用于膜電位的檢測(cè)。4. Trypan Blue 和 PMSF 對(duì)人體有害，使用時(shí)務(wù)必小心。5. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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