小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)試劑盒

MCE 國際站：Mouse Colonic Organoid Kit

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲(chǔ)條件：Basal Medium A : 4℃, 1 year. Shipping with blue ice.Supplement B (50x) & Supplement C (250x) & Supplement D (250x) : -20°C, 1 year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. Shipping with dry ice.Supplement E : Room temperature, 60 months. Shipping with blue ice.

簡介：MCE 小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)試劑盒包含小腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A，培養(yǎng)添加物 B (50x)，培養(yǎng)添加物 C (250x)，培養(yǎng)添加物 D (250x) 以及 EDTA。該產(chǎn)品可有效構(gòu)建小鼠小腸類器官。

概述：MCE 小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)試劑盒包含結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A、培養(yǎng)添加物 B (50x)，培養(yǎng)添加物 C (250x)、培養(yǎng)添加物 D (250x) 以及 EDTA。該產(chǎn)品可用于有效構(gòu)建小鼠結(jié)腸類器官。腸道隱窩底部存在的干細(xì)胞及其祖細(xì)胞具有自我更新和分化成各種腸道細(xì)胞類型的能力，以確保類器官的持續(xù)生長和維持，模擬真實(shí)結(jié)腸組織的特征。小鼠結(jié)腸類器官對于研究結(jié)腸發(fā)育、疾病機(jī)制和藥物篩選具有重要意義。

描述：

•   MCE小鼠結(jié)腸類器官試劑盒含有結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基A、結(jié)腸類器官補(bǔ)充劑B（50x）、結(jié)腸類器官補(bǔ)充劑C（250x）、結(jié)腸類器官補(bǔ)充劑D（250x）和EDTA。本產(chǎn)品可用于高效構(gòu)建小鼠結(jié)腸類器官。

•   源自原發(fā)組織的結(jié)腸類器官具有自我更新能力，可模仿真實(shí)結(jié)腸組織的特征。小鼠結(jié)腸類器官可用于研究結(jié)腸發(fā)育、疾病機(jī)制和藥物篩選。

操作說明：1. 配制小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)基冰上解凍小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)添加物 B、小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)添加物 C、小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)添加物 D，按下列組分配制小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)基，充分混勻后置于冰上備用。a. 配制小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基b. 配制小鼠結(jié)腸類器官分化培養(yǎng)基2. 提取原代組織細(xì)胞a. 使用預(yù)冷的原代組織儲(chǔ)存液浸泡新鮮提取的原代小鼠結(jié)腸組織，并置于 4°C 冰箱中暫時(shí)保存。b. 在保證無菌條件下，使用小鼠結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A 或者 PBS 沖洗已去除脂肪或肌肉等非上皮組織成分后的原代小鼠結(jié)腸組織，然后在細(xì)胞培養(yǎng)皿中用無菌剪刀將其切成盡可能小的直徑約為 2 mm 的碎片，隨后轉(zhuǎn)移至含 15 mL 錐形管中。c. 加入 10 mL 預(yù)冷的 2 mM EDTA-PBS，4°C 孵育 30 分鐘。d. 孵育完成后，讓組織片沉淀到管底，吸去上清。加入10 mL 預(yù)冷 PBS 清洗一遍。此步驟也可將組織碎片轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中用 PBS 清洗 2 次，去除 EDTA。e. 在含有預(yù)冷 PBS 的培養(yǎng)皿或者 50 mL 離心管中，用 5 mL 的移液管用力吹打破碎組織，釋放隱窩，取 10 uL 通過顯微鏡觀察確認(rèn)已分離出大量腸隱窩。f. 使用 70 μm 的濾網(wǎng)過濾，收集濾液。4°C 300 g 離心 3 分鐘，棄上清。g. 加入 1 mL PBS 重懸，取 20 μL 懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后收集重懸液 4°C 300 g 離心 3 分鐘，棄上清后置于冰上待用。3. 構(gòu)建類器官a. 在冰上將收集的隱窩重懸于基質(zhì)膠中，推薦重懸密度為每 10 μL 包含 20-120 個(gè)隱窩。重懸后盡快進(jìn)行鋪板。建議使用基質(zhì)膠原液重懸腫瘤細(xì)胞，如需稀釋，請確?；|(zhì)膠體積與稀釋所用的類器官培養(yǎng)基體積的比例高于 2:1。b. 將混懸液迅速注入 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的底部，盡量避免產(chǎn)生氣泡，每孔注入 25-35 μL 混懸液。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入 37°C，5% CO2 的培養(yǎng)箱中孵育 15-25分鐘進(jìn)行固化。c. 待基質(zhì)膠凝固后，在每個(gè)孔邊緣緩慢注入 500 μL 小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，避免破壞已有的凝膠結(jié)構(gòu)。然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放回 37°C，5% CO2 的培養(yǎng)箱中。d. 密切關(guān)注類器官生長狀態(tài)，每隔 3 天更換一次培養(yǎng)基。一般情況下，5-7 天可觀察到小鼠結(jié)腸類器官生成。4. 類器官傳代a. 吸去上層培養(yǎng)基，向孔中加入 500 μL 預(yù)冷小鼠結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A，用潤洗過的移液器吹打?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)容物剝離出培養(yǎng)板并轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP 管內(nèi)。b. 使用移液槍充分吹打混勻至類器官與基質(zhì)膠分離，250-300 g 離心 3 分鐘收集沉淀。c. 加入適量的類器官消化液置于 37°C 培養(yǎng)箱中充分消化 2 分鐘后加入 1 mL 小鼠結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A 終止消化。d. 4°C 250-300 g 離心 3 分鐘收集沉淀，加入1 mL 小鼠結(jié)腸類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基 A 重懸。e. 4°C 250-300 g 離心 3 分鐘收集沉淀，置于冰上待用。f. 在冰上將收集的隱窩重懸于基質(zhì)膠中，盡快進(jìn)行鋪板。建議使用基質(zhì)膠原液重懸腫瘤細(xì)胞，如需稀釋，建議使用基質(zhì)膠原液重懸腫瘤細(xì)胞，如需稀釋，請確?；|(zhì)膠體積與稀釋所用的類器官培養(yǎng)基體積的比例高于 2:1。g. 將混懸液迅速注入 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的底部，盡量避免產(chǎn)生氣泡，每孔注入 25-35 μL 混懸液。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板放入 37°C，5% CO2 的培養(yǎng)箱中孵育 15-25 分鐘進(jìn)行固化。h. 待基質(zhì)膠凝固后，在每個(gè)孔邊緣緩慢注入 500 μL 預(yù)熱的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，避免破壞已有的凝膠結(jié)構(gòu)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板放回 37°C，5% CO2 的培養(yǎng)箱中。i. 密切關(guān)注結(jié)腸類器官的生長狀態(tài)，當(dāng)類器官的直徑超過 100 μm 后，吸去小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，并加入 500 μL 小鼠結(jié)腸類器官分化培養(yǎng)基，每 2 天更換一次分化培養(yǎng)基。j. 密切關(guān)注結(jié)腸類器官的生長狀態(tài)，通常分化需要至少 4 天，分化的類器官可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)

注意事項(xiàng)：1. 配制后的培養(yǎng)基不建議在 4°C 冰箱中放置超過 2 周。2. 提取原代組織細(xì)胞時(shí)需保持全程無菌，避免造成后續(xù)實(shí)驗(yàn)污染。3. 基質(zhì)膠操作需全程保持低溫避免凝膠，與細(xì)胞重懸后應(yīng)將其迅速注入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，盡量避免產(chǎn)生氣泡。4. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作

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