Biorad siRNA合成新方法

 

Bio-Rad與集成DNA技術(shù)公司（Integrated DNA Technologies，IDT聯(lián)手發(fā)展一種可以獲得有效的27-mer Dicer酶作用（Dicer-substrate）siRNA雙鏈的方法。通過(guò)這種方法可以獲得有效預(yù)設(shè)的siLentMer siRNA雙鏈。

           

之前的研究認(rèn)為在沒(méi)有引起干擾素應(yīng)答（interferon response）的條件下，只有21-23nt雙鏈siRNA才能激活RNAi途徑（Elbashir et al. 2001，但是來(lái)自美國(guó)希望之城國(guó)家醫(yī)學(xué)中心（the City of Hope）和IDT的研究人員證明無(wú)干擾素應(yīng)答激活的前提下，27-nt的siRNA雙鏈實(shí)際上能有效的激活RNAi途徑，并且比經(jīng)典的21-mers siRNA更早激活這一途徑（Kim et al. 2005。這些研究數(shù)據(jù)表明27-nt雙鏈?zhǔn)怯蒖NaseIII家族成員：Dcicer酶加工獲得的，而且27-mer siRNAs常常表現(xiàn)出比21-mer siRNA能更有效的RNA干擾效果。

           

因此在這一理論基礎(chǔ)上，IDT建立了27-mer設(shè)計(jì)運(yùn)算法則（algorithm），相關(guān)生物信息學(xué)和高質(zhì)量合成方法，并推出了siLentMerDicer-substrate siRNA雙鏈合成。這些雙鏈已由Bio-Rad研發(fā)部專家經(jīng)過(guò)了性能驗(yàn)證和有效性驗(yàn)證，可以減少至少85%的mRNA表達(dá)。除此之外，這種siRNA對(duì)于建立有效siRNA庫(kù)也很合適，多種靶標(biāo)的多siRNA雙鏈合成可以產(chǎn)生復(fù)合生物學(xué)效應(yīng)，有利于特異興趣基因的確定敲除。

 

當(dāng)siRNA序列與興趣基因非特異性序列mRNA轉(zhuǎn)錄本相似的時(shí)候就會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)（off-target effects）（Jackson et al. 2003），這會(huì)引起基因表達(dá)譜的錯(cuò)誤識(shí)別，從而導(dǎo)致與目標(biāo)基因無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)錄本沉默。

為了避免這種情況出現(xiàn)，siLentMer siRNA雙鏈：

＊ 利用先進(jìn)的生物信息學(xué)對(duì)敲除特異性同源序列進(jìn)行分析，確保特異靶標(biāo)。

＊ 低濃度（≥5 nM）有效性：在siRNA高濃度的時(shí)候才會(huì)發(fā)生脫靶效應(yīng)，為了減少這一效應(yīng)，siLentMer siRNA在低濃度時(shí)提高了有效性（見(jiàn)下圖）。

＊ HPLC級(jí)純化siRNA保證了一致和可靠的結(jié)果。

siLentMer siRNA雙鏈在低siRNA濃度的有效敲除

 

HeLa細(xì)胞用10 nM 或者100 pM anti-GAPDH siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)提取總RNA，進(jìn)行iScript cDNA 合成試劑盒和iCycler iQ實(shí)時(shí)監(jiān)控RT-qPCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAPDH轉(zhuǎn)錄水平，相對(duì)于非沉默對(duì)照，已經(jīng)減少了至少95%

 

除此之外，序列有效性Anon. 2003和足夠的實(shí)驗(yàn)對(duì)照也能減少脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生，siLentMer siRNA包含了陽(yáng)性和陰性對(duì)仗，能確保沉默和簡(jiǎn)便結(jié)果分析。

                      

Anonymous author, Whither RNAi?, Nat Cell Biol 5, 489–490 2003

Elbashir SM et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494–498 2001

Jackson AL et al., Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi, Nat Biotechnol 21, 635–637 2003

Kim DH et al., Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potencyefficacy, Nat Biotechnol 23, 222–226 2005