1 質(zhì)粒DNA提取

提取質(zhì)粒的時候，zui后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長一點時間，是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是37度溫箱放長一點的時間，我試過室溫經(jīng)過一夜，酶切很好。

將amp濃度提高到200ug/ml，下班前接種，次日一早收獲菌體，此時OD雖然不高，質(zhì)粒豐度卻不一般。菌體量少些，操作體積（管數(shù)）也?。ㄉ伲?。

手提質(zhì)粒，如果用氛氯仿和氯仿兩步抽提，再注意一下手法，嚴(yán)格按照參考書上面的操作的話，提出的質(zhì)粒不比任何質(zhì)粒提取試劑盒差，我感覺好像還好一點，我就用過一次試劑盒，比較了之后不如我手提的好，以后再也沒用過了。

2 Western Blot

做western blot的時候，大家往往會摸索一抗、二抗的濃度，封閉時間，曝光時間等等，而每次變換其中的一個條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會浪費大量的時間。其實*沒有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時候取出一塊，沒有任何影響。這對于摸索條件的戰(zhàn)友來說，節(jié)約了大量的時間。

做western blot 轉(zhuǎn)膜時，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶，方便的很。因為很多時候跑電泳時膠上的預(yù)染maker很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對位移動了，以防maker失去參照價值。

器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復(fù)沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2－3遍，然后用去離子水沖洗一遍。zui后用95％酒精再擦一遍后晾干備用。

配膠現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1－2次即可。

3 緩沖液和培養(yǎng)基配置

（1）將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲存，需要的時候只需將相應(yīng)的母液混合，補(bǔ)加水稀釋即可；

（2）配培養(yǎng)基時通常會忘記各成分的量，如配LB時的三個成分不記得到底哪個是5g，哪個要10個，因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量，如配LB時，在NaCl瓶外注明10 g/L，yeast 5 g/L，tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前臨時翻書。

4 PCR

在做克隆鑒定的時候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行PCR鑒定，每次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液（100次反應(yīng)），其中含buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分裝或一管儲存在－20度，在需要的時候拿出融開，然后按所需的PCR反應(yīng)個數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：

（1）可極大的節(jié)省寶貴的時間，可早點收工，看球；

（2）避免每次反應(yīng)加樣不均的可能；

（3）大大減少PCR假陽性的產(chǎn)生。

5 酶切

如果是要做酶切，提質(zhì)粒的zui后一步是用水溶解DNA，因為TE里面的離子會影響酶切的效率。

雙酶切制備克隆插入片段的載體，選擇帶有外源片段的質(zhì)粒，是否酶切*，從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷。空質(zhì)粒單切*和雙切*在分子量上差異不大。

在做酶切時，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時有10幾個陽性克隆需要鑒定時尤為明顯：

（1）各反應(yīng)成分均一；

（2）可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用；

（3）節(jié)省時間。

6 大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗

有時候*天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長成的菌落比較大（1~2毫米以上，BL21就長得快），下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養(yǎng)基），50微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加40微升TE抽提，上層TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層TE即是質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)?？梢灾苯佑糜陔娪竞兔盖?。這樣操作，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省6~8小時的時間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的實驗室或者操作者未必能夠很方便地重復(fù)。

轉(zhuǎn)化時一定要做一個宿主菌的對照，即重組質(zhì)粒涂板后再用宿主菌涂響應(yīng)抗性的平板，以確定第二天長出來的克隆是否正確，我當(dāng)時做了三次轉(zhuǎn)化之后才發(fā)現(xiàn)不成功竟然是由于BL21可以在Amp（+）的平板上面生長。

7 蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化

當(dāng)?shù)鞍状罅康谋磉_(dá)時，包含體的形成幾乎是不可避免的，而且很難通過改變一些誘導(dǎo)條件來改變，zui有效的辦法就是換表達(dá)系統(tǒng)，所以如果時間還充分的話，可以嘗試一下，如果時間較短了，還是安心的座包含體蛋白的處理算了，而且變性之后的蛋白通過一些方法復(fù)性率也可以達(dá)到60％以上。

8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆

引物設(shè)計主要是要注意以下幾個事項：

（1）發(fā)夾結(jié)構(gòu)；

（2）反向配對；

（3）GC含量（40－60%）；

（4）退火溫度（45－65度）；

（5）引物長度（18－27bp）；

（6）3' 端是C、G（提高結(jié)合度）；

（7）引物在序列中的錯配位點。

大致就這幾個方面，重要性依次降低，由其是3' 端不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

那么你說你這段能不能設(shè)計引物呢？其實設(shè)計引物都只是好中選優(yōu)的問題。

9 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實驗

（1）可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里半小時到1小時，這樣溫度和ph值都已經(jīng)細(xì)胞生長了。

（2）為防止凍存管在升溫時爆裂等，可以在放入水浴前就實現(xiàn)在超凈臺里把蓋子擰松一下然后再擰上。從液氮罐里拿出來不是說一定要分秒必爭地放入水浴。細(xì)胞從液氮的零下1百多度升到比如負(fù)八十這個過程對細(xì)胞沒有損害。有足夠的時間handle這些。只不過一旦細(xì)胞化了，就應(yīng)該爭分奪秒地把它放入培養(yǎng)液了，主要是為了稀釋DMSO。常溫下高濃度DMSO對細(xì)胞的損害比較大。

（3）水浴溫度40℃應(yīng)該也沒問題，但正規(guī)的protocol上從來都只說37℃。反正應(yīng)該相差不大，但不能太高了。另外，不必等細(xì)胞全化了再從水浴里取出來。只要冰塊浮起來了就差不多了。我一般zui多水浴不超過1.5分鐘。然后經(jīng)過噴酒精消毒什么的差不多又半分鐘過去了。每次都還有沒化的。先把已經(jīng)融解的部分吸到培養(yǎng)瓶里，再從培養(yǎng)瓶里吸些培養(yǎng)液到凍存管里，余下的冰塊瞬間就化了，再一起吸到培養(yǎng)瓶里。

10 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

（1）RT-PCR有兩種做法

條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強(qiáng)且無拖尾現(xiàn)象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行，當(dāng)然也可能是我買的kit不太好。（promega）。

（2）RT-PCR應(yīng)具備的條件

高質(zhì)量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（產(chǎn)物短點）；若涉及粗略定量的話還應(yīng)考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內(nèi)標(biāo)分子更好，但我發(fā)現(xiàn)其實很不容易將RNA的濃度以及內(nèi)標(biāo)分子的表達(dá)量調(diào)整的*一樣）；體系的均一性等。

（3）RACE

我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現(xiàn)在再進(jìn)行另一個同源基因的3‘RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴(kuò)增出來的，其中一個已經(jīng)獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因的3’UTR卻增么也擴(kuò)不出來，我推測是不是該基因的3‘UTR太長的緣故。

（來源：丁香園）

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