一、GST pull-down實驗：

將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種“誘餌蛋白"，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白"(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白"和“捕獲蛋白"均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行，操作方便。注：GST即谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)

二、足印法（Footprinting）：

用來測定DNA-蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的方法，用于檢測目的DNA序列與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可展示蛋白質(zhì)因子同特定片段之間的結(jié)合。其原理為：DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合后，DNA與蛋白的結(jié)合區(qū)域不能被DNase（脫氧核糖核酸酶）分解，在對目的DNA序列進行檢測時便出現(xiàn)了一段無DNA序列的空白區(qū)(即蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū))，從而了解與蛋白質(zhì)結(jié)合部位的核苷酸數(shù)目及其核苷酸序列。

三、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）：

研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，利用該技術(shù)不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉(zhuǎn)錄因子與基因表達的關(guān)系。

其原理是：在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別 反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及鑒定。

四、基因芯片（又稱生物芯片）技術(shù)：

指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說，就是通過微加工技術(shù) ，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于50px2的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個二維DNA探針陣列，被稱為基因芯片?；蛐酒饕糜诨驒z測工作。

原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度zui強的探針位置，獲得一組序列*互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。

五、液相色譜（HPLC）：

在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。

高壓泵將貯液罐的流動相經(jīng)進樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，這時整個系統(tǒng)就被流動相充滿。當欲分離樣品從進樣器進入時，流經(jīng)進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，分離后不同組分依先后順序進入檢測器，記錄儀將進入檢測器的信號記錄下來，得到液相色譜圖。

六、噬菌體展示技術(shù)：

將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。

噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增"后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結(jié)合特性的目標噬菌體。

七、RNA提?。?/span>Trizol法）：

Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。

八、RT-PCR：

將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進行。

九、實時熒光定量PCR（Q—PCR）（Real-time Quantitative PCR）：

利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。

閾值：是循環(huán)開始3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，設(shè)定在擴增曲線指數(shù)增長期。

C(t)值：熒光信號（擴增產(chǎn)物）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。

十、大腸桿菌感受態(tài)細胞（E。coli DH5α）制備：

1、前夜接種受體菌（DH5?或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)到第二日（約16小時）；

2、取1ml已培養(yǎng)到第二日的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2。5-3小時（250-300rpm）；

3、將0。1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；

4、吸取1。5ml培養(yǎng)好的菌液至1。5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

5、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；

6、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0。1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；

7 、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；

8 、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0。1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。?/span>

9 、細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑（15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?/span>70℃）。

十一、堿變性提取質(zhì)粒DNA：

基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達到分離目的。在pH高達12。6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會*分離，當以pH4。8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

十二、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及克隆篩選：

（1）分---PCR分離目的基因：PCR克隆、同源克隆、文庫篩選

（2）切---限制性內(nèi)切酶切割：粘性末端、平末端

（3）接---目的基因與載體相連：利用DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個或者幾個A堿基的特性和利用T載體3’末端的T堿基和PCR產(chǎn)物的A堿基互補配對，經(jīng)連接酶作用，完成與載體的連接。

（4）轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細胞

感受態(tài)細胞：經(jīng)過電擊、CaCl2、RuCl等化學(xué)試劑處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態(tài)。

（5）篩---篩選陽性重組體

十三、RNA干擾（RNAi）：

一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。

十四、cDNA 末端快速擴增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)：

基于mRNA反轉(zhuǎn)錄和 PCR技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點，擴增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域，從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。即從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長cDNA5’和cDNA3’末端，進而獲得獲得全長cDNA簡單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、等優(yōu)點，可同時獲得多個轉(zhuǎn)錄本。因此近年來RACE技術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA文庫篩選技術(shù)，成為克隆全長cDNA序列的常用手段。

十五、mRNA差異顯示技術(shù)（DD-PCR）：

將mRN A逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。每一種細胞（包括同一組織細胞經(jīng)過不同的處理）都有其特異表達的不同于其他組織細胞的基因譜（有差異基因表達），即特異的RNA指紋圖譜。差異基因表達是細胞分化的基礎(chǔ)，正是這些基因在細胞中的特異表達與否，決定了生命歷程中細胞的發(fā)育和分化、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞衰老和凋亡等。mRNA DDR T－PCR 技術(shù)正是對組織特異性表達基因進行分離的一種快速而行之有效的方法。 其基本原理是從基因背景相同的2個或幾個被比較的細胞系或組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，用不同引物對，進行PCR 擴增，擴增時加入同位素標記的核苷酸。利用測序膠電泳技術(shù)分離PCR 產(chǎn)物，經(jīng)放射自顯影即可找到差異表達的基因。

十六、抑制差減雜交：

原理抑制差減雜交技術(shù)(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差減雜交方法相結(jié)合的方法。其依據(jù)兩點:(1)消減雜交;(2)抑制PCR。經(jīng)抑制差減雜交后的cDNA群體不僅富集了差異表達基因(目的基因)，而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除，使消減后的cDNA群體為豐度一致的目的基因群體。

抽提兩種不同來源組織的mRNA(tester和driver)，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用4堿基識別酶(RsaI)或HaeIII酶切兩種cDNA產(chǎn)生平端片段;將testerc DNA分成均等的兩份，分別接上dapter1和adapter2兩種接頭，并與過量的經(jīng)RsaI消化的driver樣本變性后退火雜交。*次雜交后有4種產(chǎn)物:a是單鏈testercDNA;b是自身退火的testercDNA雙鏈;c是tester和driver的異源雙鏈;d是drivercDNA。

根據(jù)復(fù)性動力學(xué)原理，豐度高的單鏈cDNA退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA，因此*次雜交使得豐度有差別的cDNA的單鏈分子的相對含量趨向一致。混合兩份雜交樣品，同時加入新的變性driver cDNA 進行第二次消減雜交。雜交*后補平末端，加入合適引物(即adapter1和adapter2的部分特異序列)進行PCR擴增，只有含不同接頭的雙鏈DNA分子(e)才可進行指數(shù)擴增，擴增產(chǎn)物即為目的片段。利用adapter上的酶切位點可進行克隆、測序等。

十七、雙向凝膠電泳（2-DE）：

原理是*向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。

十八、mRNA的分離與純化（寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA）：

真核細胞的mRNA分子zui顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法zui為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。

十九、His-tag純化蛋白：

His-Tag序列（6、8或10個連續(xù)的組氨酸殘基）與固定在基于NTA(氮川三乙酸鎳) -和IDA- 的His-Bind樹脂上的二價陽離子Ni2+結(jié)合。洗去未結(jié)合蛋白后，用咪唑或稍低的pH洗脫并回收目標蛋白。該通用系統(tǒng)使得可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。

二十、RNA酶保護試驗方法 (RNase Protection Assay，RPA)：

是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護實驗。

與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優(yōu)點：1。 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2。 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺"問題，基于PCR產(chǎn)物量進行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實性較高。3。由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。4。步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。5。 RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。6。 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7。 檢測分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。