簡(jiǎn)介

輔酶 Q10（CoQ10，泛醌，2,3-二甲氧基-5-甲基-6-十碳烯基-1,4-苯醌）和維生素 C（抗壞血酸）都是常用的強(qiáng)效抗氧化劑，常作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或用于化妝品中。在護(hù)膚方面，維生素 C 可以促進(jìn)膠原蛋白的生成，減少色素沉著，而輔酶 Q10 則可以保護(hù)皮膚免受氧化損傷。作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，輔酶 Q10 有助于降低血壓，而維生素 C 則有助于增強(qiáng)免疫系統(tǒng)。因此，這兩種成分經(jīng)常被一起添加到護(hù)膚或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中^[1,2]。

輔酶 Q10 存在于魚(yú)油或谷物中，是一種脂溶性維生素樣物質(zhì)，因此它不溶于水。維生素C是一種水溶性維生素。因此，挑戰(zhàn)在于將這兩種維生素分離開(kāi)來(lái)，其中一種（維生素 C）極性很強(qiáng)，而另一種（輔酶Q10）極性很弱。本應(yīng)用說(shuō)明展示并比較了使用制備 HPLC 和制備 SFC 分離混合物中的輔酶 Q10 和維生素C。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

• Pure C-850

• PrepPure C18 column, 15 um, 150 x 20 mm

• Sepiatec SFC-50

• PrepPure Silica column, 5 um, 250 x 10 mm

化學(xué)品與樣品

化學(xué)品：

• 甲醇, 色譜級(jí)

• 二氧化碳(CO₂)

• 注射器過(guò)濾器

• 異丙醇

• 去離子化水

為了安全處理，請(qǐng)注意所有相應(yīng)的MSDS！

樣品：

• 維生素 C（抗壞血酸）

• 100% 輔酶 Q10

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實(shí)驗(yàn)過(guò)程

對(duì)于樣本，每種物質(zhì)（CoQ10 營(yíng)養(yǎng)粉和維生素 C）均用100%異丙醇稀釋至濃度為 25mg/mL，然后將樣本超聲處理 15 分鐘。

制備HPLC

• 儀器: Pure C-850

• 色譜柱: PrepPure C18, 15 um, 150 x 20 mm

• 流動(dòng)相: 異丙醇 (IPA)

• 流動(dòng)相條件: 100% 異丙醇等度洗脫

• 流速: 20 mL/min

• 檢測(cè)器: UV1: 254nm

  UV2: 265nm

  UV3: 280nm

  UV4: 320nm

• 進(jìn)樣體積: 1mL

• 平衡時(shí)間: 10min

制備SFC

• 儀器: Sepiatec SCF-50

• 色譜柱: PrepPure Silica, 5 um, 250x10 mm

• 流動(dòng)相：A = 二氧化碳 (CO₂); B = 甲醇

• 流動(dòng)相條件: 0–2 min: 40% 甲醇

• 流速: 20mL/min

• 檢測(cè)器: 270nm

• 進(jìn)樣體積: 0.1mL

• 平衡時(shí)間: 1min

結(jié)果

制備 HPLC

色譜圖（圖1）顯示維生素 C 在 1.3min 和輔酶 Q10 在 3.5min 的色譜峰，維生素 C 和輔酶 Q10 的最大吸收波長(zhǎng)分別為 254nm 和 265nm。

由于輔酶 Q10 在水中不溶性，并且在醇相（如甲醇或乙醇）中的溶解度非常有限，因此溶劑的選擇非常有限。

制備 SFC

圖2 顯示，輔酶 Q10 的色譜峰出現(xiàn)在 1min 后，維生素 C 的色譜峰出現(xiàn)在 1.3min 后。選擇 265nm 波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，這解釋了較低的吸光度。由于選擇了硅膠作為固定相，非極性的輔酶 Q10 首先流出色譜柱，而極性更強(qiáng)的維生素 C 與硅膠的相互作用更強(qiáng)，因此流出色譜柱的時(shí)間較晚。

由于這是一種等度洗脫運(yùn)行，因此適用于疊加進(jìn)樣。選擇了與單次進(jìn)樣相同的條件，疊加時(shí)間為 0.72min，進(jìn)樣 10 次，如 圖3 所示。總運(yùn)行時(shí)間為 8 min，平衡時(shí)間為 1.5min。

通過(guò)堆疊，1mL 的樣品能夠得以純化，這與制備型高效液相色譜（prep HPLC）運(yùn)行時(shí)所使用的樣品量相同。在此需要指出的是，制備型超臨界流體色譜（prep SFC）中使用的是 250×10mm 的色譜柱，而制備型高效液相色譜（prep HPLC）中使用的則是 150×20mm 的色譜柱。此次堆疊運(yùn)行的總運(yùn)行時(shí)間為 8 分鐘。

Prep HPLC 與 Prep SFC 對(duì)比

色譜中典型的分離可分為 5 個(gè)步驟：

1. 準(zhǔn)備：這包括準(zhǔn)備樣品，準(zhǔn)備溶劑，打開(kāi)儀器并確保儀器工作。

2. 編輯分離所需設(shè)置的方法參數(shù)。

3. 在制備 HPLC 的情況下，啟動(dòng) purge 功能；在制備 SFC 的情況下，清洗泵。

4. 運(yùn)行：這包括平衡過(guò)程和運(yùn)行過(guò)程。

5. 清洗：這一步包括將色譜柱清洗干凈并保存，清洗進(jìn)樣閥，用異丙醇沖洗儀器。

時(shí)間上的不同

表1 顯示了制備型 SFC 和制備型 HPLC 運(yùn)行之間的時(shí)間差異。對(duì)于 SFC，最長(zhǎng)的時(shí)間是將溫度加熱到 40°C 的柱溫 20 分鐘。值得注意的是，在此期間用戶(hù)可以輕松地完成其他任務(wù)。對(duì)于 HPLC，儀器的開(kāi)啟速度很快，但同樣需要準(zhǔn)備樣品的時(shí)間。

兩種儀器的運(yùn)行程序是相同的

如果 SFC 長(zhǎng)時(shí)間未使用，CO₂ 可能會(huì)遷移到泵中，因此在開(kāi)始運(yùn)行之前，需要對(duì)泵進(jìn)行 Purge。在所有的 Sepiatec 儀器上，都是通過(guò)軟件指導(dǎo)您完成這一步。在 HPLC 上，溶劑管路需要手動(dòng) Purge。

在 HPLC 中，最長(zhǎng)的時(shí)間是運(yùn)行過(guò)程。建議平衡 3-5 個(gè)柱體積。在這里的應(yīng)用實(shí)例中，平衡是在 4 CV 下完成的。當(dāng)使用 SFC 時(shí)，平衡只需要 2min。

另一個(gè)明顯的區(qū)別是，HPLC 的清洗需要 16min，而 SFC 儀器的清洗僅僅需要 2min。在 HPLC 運(yùn)行結(jié)束時(shí)，有必要將色譜柱保存在 80%MeOH/20% 水的條件，而在 SFC 中，色譜柱可以在運(yùn)行結(jié)束時(shí)存儲(chǔ)，不需要任何額外的步驟。對(duì)于 SFC，需要的清潔是沖洗進(jìn)樣器。而為了確保 HPLC 始終處于工作狀態(tài)，在關(guān)閉儀器之前需要用異丙醇（IPA）沖洗儀器。這增加了另一個(gè)步驟，這在使用 SFC 儀器時(shí)是不必要的。

表1：制備型 SFC 和制備型 HPLC 純化等量樣品的時(shí)間差異。

溶劑消耗上的不同

在兩種方式中，樣品制備都需要 IPA，這也是 HPLC 運(yùn)行所選擇的流動(dòng)相。SFC 方法采用甲醇和 CO₂。HPLC 需要額外的溶劑來(lái)保存色譜柱，如水和甲醇。水是一種綠色流動(dòng)相，但由于它與儀器中的溶劑混合在一起，因此仍然需要丟棄在化學(xué)廢物中。在 表2 中顯示，在 HPLC 運(yùn)行中產(chǎn)生的溶劑浪費(fèi)比 SFC 運(yùn)行多 7.5 倍。

表2：制備型 SFC 和制備型 HPLC 純化等量樣品的溶劑消耗差異。

結(jié)論

CoQ10 和維生素 C 這類(lèi)脂溶性和水溶性化合物的混合物可以用制備型 HPLC 和制備型 SFC 分離，HPLC 的固定相為 C18，即極性的維生素 C 先洗脫，非極性的輔酶 Q10 后洗脫。SFC 所用的固定相為二氧化硅，洗脫順序相反。純化等量樣品時(shí)，SFC 系統(tǒng)的操作時(shí)間（40 min）比 HPLC 系統(tǒng)的操作時(shí)間（58 min）短得多，除此之外，SFC 所用的溶劑相較于 HPLC 減少了約 7.5 倍。

參考文獻(xiàn)

1. Wu, H.-S., Tsai, J.-J., Separation and purification of coenzyme Q10 from Rhodobacter sphaeroides. J. Taiwan Inst. Chem. Eng. (2013),

2. dx.doi.org/10.1016/j.jtice.2013.03.013.

3. See, X. Z., Yeo, W. S., & Saptoro, A. (2024). A comprehensive review and recent advances of vitamin C: Overview, functions, sources, applications, market survey and processes. Chemical Engineering Research and Design, 206, 108–1doi.org/10.1016/j.cherd.2024.04.048.