??1. 工作原理??
冷凍聚焦離子束顯微鏡(??Cryo-FIB??)是一種結(jié)合 ??聚焦離子束(FIB)加工?? 和 ??冷凍電子顯微鏡(Cryo-EM)樣品制備?? 的技術(shù),主要用于對 ??冷凍生物樣品?? 或 ??敏感材料?? 進行納米級精密切削和成像。其核心工作原理如下:

??(1)冷凍樣品制備??
- 樣品通過 ??快速冷凍(如液氮冷卻)?? 形成玻璃態(tài)冰(Vitreous Ice),避免冰晶損傷。
- 冷凍樣品轉(zhuǎn)移至 ??Cryo-FIB?? 系統(tǒng),保持 ??低溫(約 -140°C 至 -180°C)??,防止水蒸發(fā)或結(jié)構(gòu)破壞。
??(2)聚焦離子束(FIB)加工??
- ??離子源(Ga? 或 He?/Ne?)?? 發(fā)射高能離子束(典型能量 ??30 keV??)。
- 離子束聚焦至 ??納米級束斑(5–10 nm)??,轟擊樣品表面,通過 ??濺射效應?? 去除材料。
- ??精確控制離子束掃描??,實現(xiàn) ??薄片制備(<200 nm)?? 或 ??表面刻蝕??,用于后續(xù)冷凍電鏡(Cryo-EM)或冷凍電子斷層掃描(Cryo-ET)觀察。
??(3)電子束成像(可選)??
- 部分 ??Cryo-FIB/SEM?? 系統(tǒng)集成 ??掃描電子顯微鏡(SEM)??,可在加工過程中實時觀察樣品形貌(低劑量成像)。
??2. 系統(tǒng)構(gòu)成??
Cryo-FIB 系統(tǒng)主要由以下關(guān)鍵模塊組成:
??(1)冷凍樣品傳輸與保持系統(tǒng)??
- ??冷凍樣品臺(Cryo-stage)??:保持樣品在 ??-140°C 至 -180°C?? 低溫環(huán)境。
- ??防污染冷阱(Anti-contamination Cold Trap)??:減少水汽凝結(jié),避免樣品污染。
- ??冷凍傳輸裝置??:將樣品從冷凍制備設(shè)備(如 plunge freezer)安全轉(zhuǎn)移至 FIB 腔室。
??(2)離子束系統(tǒng)??
- ??離子源??:常用 ??鎵離子(Ga?)??,系統(tǒng)可選 ??氦離子(He?)?? 或 ??氖離子(Ne?)??,提供更高分辨率加工。
- ??離子光學系統(tǒng)??:靜電透鏡和偏轉(zhuǎn)線圈控制離子束聚焦與掃描。
- ??束斑控制??:可實現(xiàn) ??5–100 nm?? 束斑調(diào)節(jié),適應不同加工需求。
??(3)電子束成像系統(tǒng)(可選)??
- ??掃描電子顯微鏡(SEM)模塊??:低電壓(1–5 keV)電子束成像,減少樣品損傷。
- ??二次電子(SE)或背散射電子(BSE)探測器??:用于加工過程的實時監(jiān)控。
??(4)氣體注入系統(tǒng)(GIS)??
- ??沉積氣體(如 Pt、C)??:用于 ??保護層沉積?? 或 ??修復損傷區(qū)域??。
- ??刻蝕氣體(如 XeF?)??:增強特定材料的離子束刻蝕效率。
??(5)控制系統(tǒng)與軟件??
- ??自動化切片軟件??:預設(shè)加工路徑,實現(xiàn) ??自動薄片制備??(如 AutoSlice & View)。
- ??低劑量成像模式??:減少電子束對敏感樣品的輻照損傷。
??3. 技術(shù)優(yōu)勢與挑戰(zhàn)??
??(1)優(yōu)勢??
- ??保持樣品天然狀態(tài)??:冷凍環(huán)境避免水蒸發(fā)和結(jié)構(gòu)塌陷,適用于 ??生物大分子、細胞、軟材料??。
- ??高精度加工??:納米級定位切削,制備 ??Cryo-EM 所需超薄樣品(<200 nm)??。
- ??多模態(tài)聯(lián)用??:結(jié)合 ??Cryo-SEM、Cryo-ET??,實現(xiàn)從加工到高分辨成像的全流程分析。
??(2)挑戰(zhàn)??
- ??冰污染風險??:樣品轉(zhuǎn)移過程中可能形成非晶冰,影響成像質(zhì)量。
- ??離子束損傷??:高能離子轟擊可能導致樣品非晶化或成分改變(需優(yōu)化束流參數(shù))。
- ??設(shè)備復雜度??:需嚴格維持低溫、高真空環(huán)境,操作與維護成本高。
??4. 典型應用??
- ??結(jié)構(gòu)生物學??:制備 ??冷凍電鏡(Cryo-EM)?? 樣品,解析蛋白質(zhì)復合體或病毒結(jié)構(gòu)。
- ??材料科學??:加工 ??鋰金屬負極、水凝膠?? 等敏感材料,研究界面或缺陷結(jié)構(gòu)。
- ??細胞生物學??:對冷凍細胞進行 ??原位截面制備??,用于冷凍電子斷層掃描(Cryo-ET)。
??5. 未來發(fā)展方向??
- ??更低損傷離子源??:如 ??氦離子(He?)?? 替代 Ga?,減少樣品損傷。
- ??AI 輔助自動化??:智能識別感興趣區(qū)域(ROI),優(yōu)化加工路徑。
- ??多束聯(lián)用平臺??:集成 ??離子束、電子束、X射線??,實現(xiàn)多維數(shù)據(jù)采集。
??6. 總結(jié)??
冷凍聚焦離子束顯微鏡(Cryo-FIB)通過 ??低溫離子束加工??,解決了傳統(tǒng) FIB 對生物和敏感材料的損傷問題,成為 ??冷凍電鏡樣品制備?? 和 ??納米材料研究?? 的關(guān)鍵工具。其技術(shù)核心在于 ??低溫環(huán)境控制、高精度離子束切削?? 和 ??多模態(tài)聯(lián)用能力??,未來將進一步向 ??低損傷、智能化、高通量?? 方向發(fā)展。
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