Morris Water Maze水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris Water Maze水迷宮是一種主要用于測試嚙齒類動(dòng)物空間記憶獲得的實(shí)驗(yàn)范式(Morris，1984)。盡管MWM是以大鼠為中心設(shè)計(jì)的，但它也已成為小鼠行為神經(jīng)科學(xué)測試的主要工具。大量研究表明MWM作為一種測試和評(píng)估空間認(rèn)知的方法是非?？煽亢蜏?zhǔn)確的。也有文獻(xiàn)證實(shí)了該模型在研究認(rèn)知受損的神經(jīng)退行性和神經(jīng)精神疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ两鹕?，精神分裂等）時(shí)的實(shí)用性。水迷宮任務(wù)主要設(shè)計(jì)用于測量空間學(xué)習(xí)和記憶，已經(jīng)在評(píng)估衰老、實(shí)驗(yàn)性損傷和藥物作用方面變得非常有用，特別是在嚙齒類動(dòng)物中。

與其他行為學(xué)范式相比，水迷宮實(shí)驗(yàn)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

a. 動(dòng)物不需要進(jìn)行訓(xùn)練

b. 消除了嗅覺線索的干擾

c. 通過視頻跟蹤裝置，可以識(shí)別非記憶行為或運(yùn)動(dòng)缺陷

d. 通過改變平臺(tái)的位置和高度，靈活測試學(xué)習(xí)、再學(xué)習(xí)、記憶消除等過程

e. 設(shè)備成本相對(duì)較低，技術(shù)人員也易于掌握

1. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

a. 圓形水迷宮

理想直徑1.2-1.8m，可以是深色塑料材質(zhì)；水迷宮內(nèi)含直徑10~12cm的平臺(tái)（建議顏色和水迷宮內(nèi)壁相同，使得平臺(tái)對(duì)動(dòng)物而言是不可見的），位于某一象限的中心；有些水迷宮有加熱器。建議在水迷宮外周懸掛簾子（隱藏實(shí)驗(yàn)者和等待的動(dòng)物）。

b. 水

溫度20~26℃的清水，可將水加至高度超過平臺(tái)1cm；最好將水迷宮安裝在能連接水池的房間，方便加水或放水。

C. 空間定向的視覺提示

例如，使用A4紙打印的正方形、三角形、圓形、五角星等，貼在水迷宮周圍動(dòng)物可以看到的位置，如墻壁上。

d. 攝像機(jī)

一種能俯瞰迷宮的高分辨率視頻記錄裝置，建議選擇Basler單色/彩色工業(yè)相機(jī)。

e. 計(jì)算機(jī)和軟件

使用Noldus EthoVision XT軟件直接控制攝像機(jī)，并支持實(shí)時(shí)采集分析數(shù)據(jù)。軟件從視頻材料中識(shí)別大/小鼠，追蹤其運(yùn)動(dòng)軌跡，分析統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)時(shí)間、距離、速度等參數(shù)

f. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

準(zhǔn)備對(duì)照組、不同處理組的大鼠or小鼠

2. 隱藏平臺(tái)試驗(yàn)

每只大/小鼠每天進(jìn)行四次試驗(yàn)，連續(xù)四天。

a. 在Noldus EthoVision XT軟件中設(shè)置好測試流程，如樣本數(shù)量、ID，追蹤時(shí)間，截止時(shí)間等；

b. 每次試驗(yàn)，將大/小鼠從水迷宮的不同象限分別輕輕放入水迷宮中，此順序是隨機(jī)的，如Q1-Q3-Q2-Q4，保證每天四次試驗(yàn)的象限順序不同。注意放入時(shí)應(yīng)使得動(dòng)物朝向迷宮壁，不要使其頭部伸入水下。

c. 在每次試驗(yàn)中，給予動(dòng)物90s（此時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)可修正）時(shí)間探索隱藏在水面下部的平臺(tái)；若動(dòng)物在90s內(nèi)找到平臺(tái)，允許其在平臺(tái)上休息30s，之后立即進(jìn)行下一次試驗(yàn)；若動(dòng)物在90s內(nèi)未成功找到平臺(tái)，將其放到平臺(tái)上休息30s，也立即進(jìn)行下一次試驗(yàn)；

d. 每只動(dòng)物進(jìn)行四次試驗(yàn)后，用毛巾擦干放回飼養(yǎng)籠。之后三天重復(fù)同樣的實(shí)驗(yàn)（共四天）。

3. 探索試驗(yàn)

第5天，將平臺(tái)從迷宮中取出，進(jìn)行探索測試，此測試主要測量在四個(gè)象限中的每一個(gè)象限中游泳的時(shí)間和距離。提供了對(duì)先前平臺(tái)位置記憶的強(qiáng)度和準(zhǔn)確性的第二次估計(jì)。

a. 設(shè)置好計(jì)算機(jī)和EthoVision XT軟件程序后，將動(dòng)物放入與平臺(tái)所在象限相對(duì)的象限內(nèi)，方法和注意事項(xiàng)同上。

b. 記錄動(dòng)物在90s內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，計(jì)算動(dòng)物在各個(gè)象限的游動(dòng)時(shí)間、距離，以及穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)等。將動(dòng)物取出后重復(fù)一次，取兩次的平均值。

注：有些實(shí)驗(yàn)會(huì)有不同的Protocol，例如隱藏平臺(tái)測試階段：每天兩次試驗(yàn)共持續(xù)六天，或每天一次試驗(yàn)共持續(xù)十四天，如下圖所示。

4. 可見平臺(tái)試驗(yàn)（可選）

執(zhí)行本測試可以鑒別藥物或其它實(shí)驗(yàn)操作是否導(dǎo)致視覺敏銳度的變化。這種改變可能會(huì)混淆依賴于視覺線索進(jìn)行任務(wù)操作的數(shù)據(jù)分析。

a. 在探索測試之后，立即將平臺(tái)放置在原象限相對(duì)的象限內(nèi)，超出水面之上約1.5cm；

b. 改變照明，使得視覺提示不再可見，而平臺(tái)的照明度更高；

c. 從平臺(tái)所在象限的對(duì)立象限放入動(dòng)物，讓其定位平臺(tái)，第一次試驗(yàn)沒有時(shí)間限制，動(dòng)物找到平臺(tái)后休息30s；然后以同樣的方式進(jìn)行第二次試驗(yàn)，記錄找到平臺(tái)的潛伏期。

注：可以重復(fù)多次，每次試驗(yàn)均需要將平臺(tái)位置改變，以避免動(dòng)物使用其他視覺線索進(jìn)行定位。

5. 再學(xué)習(xí)試驗(yàn)（可選）

完成前面的測試，經(jīng)過一段時(shí)間的休息期（通常至少一周或更長），將平臺(tái)位置改變到不同的象限，再次進(jìn)行隱藏平臺(tái)測試。然后比較每日表現(xiàn)。此步驟可用于在同一組動(dòng)物中比較不同藥物劑量或其他附加操作的作用。

6. 數(shù)據(jù)分析

使用EthoVision XT快速進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；

隱藏平臺(tái)試驗(yàn)階段：將每只動(dòng)物每天的數(shù)據(jù)（四次試驗(yàn)）取平均值，包括找到平臺(tái)的潛伏期，運(yùn)動(dòng)距離。

探索試驗(yàn)階段：將每只動(dòng)物的兩次數(shù)據(jù)取平均值，包括在目標(biāo)象限內(nèi)的時(shí)間百分比，目標(biāo)象限內(nèi)的游動(dòng)距離的百分比，越過原平臺(tái)位置的次數(shù)。

可見平臺(tái)試驗(yàn)階段：每只動(dòng)物找到可見平臺(tái)的潛伏期。

再學(xué)習(xí)試驗(yàn)階段：方法同隱藏平臺(tái)試驗(yàn)階段。

除以上經(jīng)典Protocol外，水迷宮試驗(yàn)也有多種變體，如：

地點(diǎn)記憶試驗(yàn)：先進(jìn)行隱藏平臺(tái)試驗(yàn)，之后對(duì)大/小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作（如腦部損傷、藥物處理或其他操作），然后用附加的隱藏平臺(tái)測試或探索測試進(jìn)行重新測試。本試驗(yàn)可研究實(shí)驗(yàn)操作對(duì)整個(gè)任務(wù)過程的影響。

平臺(tái)識(shí)別試驗(yàn)：在水迷宮中兩個(gè)象限內(nèi)分別防止一個(gè)剛性平臺(tái)（可承受動(dòng)物的重量）和一個(gè)柔性平臺(tái)（不可承受動(dòng)物的重量）。使得動(dòng)物通過學(xué)習(xí)房間中的視覺線索辨別正確的平臺(tái)（空間記憶），或直接辨別兩個(gè)平臺(tái)視覺上的差異進(jìn)行選擇（非空間記憶）。

記憶消除試驗(yàn)：當(dāng)動(dòng)物知道線索不再能預(yù)測隱藏平臺(tái)的位置時(shí)，對(duì)空間位置的偏好就會(huì)減少。雖然不常用，水迷宮試驗(yàn)也可以評(píng)估記憶消除的過程。首先在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)中訓(xùn)練動(dòng)物達(dá)到較好的水平（標(biāo)準(zhǔn)是：在四個(gè)連續(xù)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隱藏平臺(tái)的潛伏期小于10-15s）；隨后，進(jìn)行四個(gè)或更多連續(xù)的探索試驗(yàn)，以評(píng)估動(dòng)物消除其對(duì)之前平臺(tái)位置的空間記憶的水平。

總之，配備EthoVision XT視頻跟蹤系統(tǒng)的水迷宮已經(jīng)成為嚙齒類動(dòng)物常用且被廣泛接受的行為范式。它既可以研究空間學(xué)習(xí)記憶，也可以研究非空間學(xué)習(xí)記憶，以及研究工作記憶過程和消除過程等。

附：

北京質(zhì)研科研有限公司的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤軟件EthoVision XT是自動(dòng)跟蹤并分析動(dòng)物活動(dòng)和行為的專業(yè)軟件，適用于各種從簡單到復(fù)雜的試驗(yàn)、高通量研究和外部設(shè)備控制等。

軟件特點(diǎn)：

應(yīng)用廣泛的視頻跟蹤軟件，文章數(shù)量超過10000篇

跟蹤分析任何動(dòng)物的行為、活動(dòng)和軌跡

適用于大部分標(biāo)準(zhǔn)行為學(xué)測試方案，包括水迷宮

高通量、高內(nèi)涵的測試方案

具有五大檢測算法，幾乎適用于所有測試場景

作為行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心，控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程

支持進(jìn)行復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如根據(jù)動(dòng)物行為實(shí)時(shí)反饋或給予刺激

·       [1]Jerry J. Buccafusco. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience, Second Edition[M].CRC Press:2008-10-29.

·       [2]Jerry J. Buccafusco,Jerry J. Buccafusco. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience[M].CRC Press:2000-08-29.