2. 純化流程

2.1 Buffer的準(zhǔn)備

Ni層析介質(zhì)(NTA) Ni NTA Beads可使用下列推薦Buffer，也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm濾膜過濾除菌。因?yàn)镹i層析介質(zhì)（NTA）可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化，兩種方法所需Buffer不同，具體配置方法見表3，表4和表5。

表3. 可溶性組氨的酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方

名稱 體積 配方

Lysis Buffer

  1L 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）

300 mM NaCl （17.54 g NaCl）

10 mM imidazole （0.68 g imidazole）

使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

Wash Buffer

  1L 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）

300 mM NaCl （17.54 g NaCl）

20 mM imidazole（1.36 g imidazole）

使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

Elution Buffer 1L 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）

300 mM NaCl （17.54 g NaCl）

250 mM imidazole （17.0 g imidazole）

使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

表4. 包涵體組氨的酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方，pH洗脫方式

名稱 體積 配方

Lysis Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea）

100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）

100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）

使用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至8.0

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

Wash Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea ）

100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）

100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）

使用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.3

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

Elution Buffer 1L 8 M Urea（480.50 g urea）

100 mM NaH2PO4（15.60 g NaH2PO4·2H2O）

100 mM Tris·HCl（15.76 g Tris·HCl）

使用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

表5. 包涵體組氨的酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方，咪唑洗脫方式

名稱 體積 配方

Lysis Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea）

50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）

300 mM NaCl （17.54 g NaCl）

10 mM imidazole （0.68 g imidazole）

使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

Wash Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea）

50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）

300 mM NaCl （17.54 g NaCl）

20 mM imidazole （1.36 g imidazole）

使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

Elution Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea）

50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）

300 mM NaCl （17.54 g NaCl）

250 mM imidazole （17.0 g imidazole）

使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，

使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

2.2 樣品準(zhǔn)備

2.2.1 細(xì)菌或酵母表達(dá)可溶性蛋白

1.挑取單菌落到培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說明，加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

2.表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7,000rpm(7500 ×g)離心15min收集菌體，然后按照菌體：Lysis Buffer=1：10（W/V）加入Lysis Buffer，加入最終濃度為1mM的PMSF。加入溶菌的酶（工作濃度為0.2-0.4mg/ml，如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS 或pLysE，可以不加溶菌的酶），同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與層析介質(zhì)的結(jié)合。

3.將菌體沉淀懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10μg/ml RNaseA和5μg/ml DNase I），混勻，放置于冰上，然后冰上超聲破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

4.將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10,000rpm(15000 ×g) 4℃離心20-30分鐘。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

2.2.2 酵母、昆蟲和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1.將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯，5,000rpm(3800 ×g)離心10min，收集菌體得上清，如上清中不含EDTA、組氨的酸和還原劑等物質(zhì)，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、組氨的酸和還原劑等物質(zhì)，蛋白還需用Lysis Buffer 下透析才能加入柱子。  

2.對(duì)于大體積上清，需加硫酸銨沉淀濃縮，蛋白還需用Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.2.3包涵體蛋白純化（變性條件）

1.將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7,000rpm(7500 ×g)，離心15min收集菌體棄掉上清。

2.按照菌體：Lysis buffer（不含8M尿素）=1:10（W/V）將菌體懸浮起來，混勻，冰浴超聲波破碎。

3.將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10,000rpm(15000 ×g)下4℃離心20-30min，去掉上清,步驟2和3可以重復(fù)一次。

4.按照菌體：Lysis buffer（含8M尿素）=1:10（W/V）將包涵體懸浮起來。

5.變性條件下進(jìn)行His標(biāo)簽抗體純化，具體緩沖液配方見表4，表5。

2.3Ni NTA Beads 重力柱的裝填

1.取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤(rùn)洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

2.將Ni NTA Beads混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質(zhì)實(shí)際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護(hù)液。

3.加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。

4.裝入潤(rùn)洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平。

5.裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液，4-30℃保存。

2.4樣品純化

2.4.1 孵育法純化

1.根據(jù)純化的樣品量，取適量層析介質(zhì)加入離心管中，1000 rpm離心1 min，吸棄上清；也可加入重力柱中，流干保護(hù)液。

2.向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的Lysis buffer清洗介質(zhì)，1000 rpm離心1 min，吸棄上清；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干Lysis buffer；重復(fù)兩次以上。

3.加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4 ℃振蕩孵育2-4 h或者37 ℃孵育30 min-2 h。

4.孵育結(jié)束后，1000 rpm離心1 min,吸棄上清，或過濾收集介質(zhì)，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

5.用5倍介質(zhì)體積的Wash Buffer清洗介質(zhì)，1000 rpm離心1 min或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到介質(zhì)），重復(fù)3-5次，中間建議更換新離心管。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

6.加入3-5倍柱體積的Elution Buffer進(jìn)行洗脫，室溫孵育10-15min, 1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重復(fù)2-3次。

2.4.2 重力柱法純化

1.將裝填好的層析介質(zhì)重力柱，用5倍柱體積的Lysis buffer進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，重復(fù)2-3次。

2.將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時(shí)間至少2 min,保證樣品和介質(zhì)充分接觸，收集流出液，可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

3.用10-15倍柱體積的Wash Buffer進(jìn)行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

4.使用5-10倍柱體積的Elution Buffer洗脫，分段收集，每一個(gè)柱體積收集一管，分別檢測(cè)，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

注：上述步驟介質(zhì)洗脫結(jié)束后，先用Lysis buffer沖洗3倍柱體積，然后用純水沖洗5倍柱體積，再用20%的乙醇沖洗2個(gè)柱體積，然后將介質(zhì)置于4度保存。

2.4 SDS-PAGE檢測(cè)

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

3. 在位清洗

當(dāng)層析介質(zhì)使用過程中反壓過高或?qū)游鼋橘|(zhì)上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí)，需要進(jìn)行在位清洗（Cleaning-in-Place, CIP）。

建議按照下面操作去除層析介質(zhì)上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類 

通過使用30%異丙醇清洗5-10個(gè)柱體積，接觸時(shí)間為15-20分鐘可以去除此類污染物。然后，再使用10倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液，清洗層析介質(zhì)2倍柱體積。例如，含有0.1–0.5% 非離子去污劑的0.1 M 醋酸溶液，接觸時(shí)間為1–2小時(shí)。去污劑處理后，需要使用70%的乙醇清洗5個(gè)柱體積，以去除去污劑。最后使用10倍柱體積的去離子水清洗。

去除離子作用結(jié)合的蛋白 

使用1.5M NaCl溶液接觸時(shí)間為10-15分鐘清洗。然后，再使用去離子水清洗10個(gè)柱體積。

4. 層析介質(zhì)再生

組氨的酸標(biāo)簽蛋白親和純化層析介質(zhì)所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)層析介質(zhì)使用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺，或者層析介質(zhì)載量明顯變低時(shí)，需要進(jìn)行對(duì)層析介質(zhì)進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子，也就是層析介質(zhì)再生。將層析介質(zhì)裝填在合適的層析柱內(nèi)，按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

1.使用去離子水清洗5倍柱體積； 

2.使用5倍柱體積100 mM EDTA (pH 8.0)剝離鎳離子； 

3.使用10倍柱體積去離子水清洗填料； 

4.使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積,停留10-15min； 

5.使用去離子水清洗填料，直至pH中性；   

6.使用3-5倍柱體積100 mM NiSO4再生掛鎳； 

7.使用10倍柱體積去離子水清洗；  

再生的層析介質(zhì)，可以立即使用，如不立即使用，需將層析介質(zhì)懸浮于等體積的20%的乙醇中，置于4-30°C保存。

5. 問題及解決方案

Ni層析介質(zhì)(NTA) Ni NTA Beads 問題 原因分析 推薦解決方案

柱子反壓過高 層析介質(zhì)被堵塞 按照3.對(duì)層析介質(zhì)的在位清洗。

裂解液中含有微小的固體顆粒，建議上柱前使用濾膜（0.2 or 0.45 μm）過濾，或者離心去除。

樣品太粘稠 樣品中含有高濃度的核酸，加長(zhǎng)破碎時(shí)間直至粘度降低，或者添加DNase I （終濃度5 μg/ml），Mg2+ （終濃度 1 mM），冰上孵育10-15分鐘。

緩沖液太粘稠 有機(jī)溶劑或者蛋白穩(wěn)定試劑（如甘油等）可能會(huì)引起反壓增高，降低操作流速。

洗脫組分中沒有目的蛋白 蛋白可能是包涵體，沒有在上清中 可以通過電泳檢測(cè)裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵體蛋白需要按照包涵體蛋白的純化方式。

表達(dá)量太低 優(yōu)化表達(dá)條件。

目的蛋白結(jié)合比較弱，在洗雜步驟被洗下來了 提高wash Buffer的pH，或者降低咪唑濃度。

目的蛋白結(jié)合過強(qiáng)，不容易洗脫下來 降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑濃度。

使用10-100mM EDTA溶液剝離鎳離子，同時(shí)得到目的蛋白。

蛋白降解 在4°C下進(jìn)行純化操作。

菌體破碎時(shí)添加一些蛋白酶抑制劑。

洗脫組分不純（含有多種蛋白） 洗雜不增加Wash Buffer體積。

樣品中含有其他的組氨的酸標(biāo)簽蛋白 通過調(diào)節(jié)pH值，或者咪唑濃度來優(yōu)化洗雜條件。再使用其他的純化手段（如離子交換，疏水等）進(jìn)一步純化洗脫組分。

層析介質(zhì)顏色變淺或變成白色 鎳離子脫落或被剝離 按照4.層析介質(zhì)再生中的建議重新掛鎳離子

層析介質(zhì)呈現(xiàn)褐色 緩沖液中含有DTT等還原劑 適當(dāng)降低還原劑DTT的濃度至2mM以下，或者改用巰基乙醇。

上樣過程中蛋白發(fā)生沉淀 操作溫度太高 4℃下進(jìn)行上樣。

蛋白發(fā)生聚集 在樣品和所有的緩沖液中添加穩(wěn)定劑，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。