吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100T/48S
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：
脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不
同，分為谷氨酸( Glu) 和鳥(niǎo)氨酸( Orn) 兩條合成途徑。
吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS， Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是以谷氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶，對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。
測(cè)定原理：
吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成 P5C 過(guò)程中分解ATP 生成ADP 和無(wú)機(jī)磷，通過(guò)鉬酸銨比色法測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷的量可確定P5CS 活性。
組成：
產(chǎn)品名稱(chēng) | BH6018-100T/48S | Storage |
試劑一：液體 | 60ml | 4℃ |
試劑二：液體 | 12 ml | 4℃ |
試劑三：液體 | 12 ml | 4℃ |
試劑四：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑五：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑六：液體 | 25ml | RT |
試劑七：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 | 10ml | 4℃ |
說(shuō)明書(shū) | 1 份 |
試劑四用時(shí)加入 25 ml 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周；試劑五用時(shí)加入 25 ml 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周；
0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：
將試劑七 20 倍稀釋?zhuān)慈?0.1ml 試劑七加 1.9ml 蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制：
按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
自備儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣品酶液的制備：
1、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入
1ml 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
操作步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 660nm。
2、酶促反應(yīng)（在EP 管中加入下列試劑）
| 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
試劑二（μl） |
| 100 |
樣本（μl） |
| 100 |
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 10min
試劑三（μl） | 100 | 100 |
試劑二（μl） | 100 |
|
樣本（μl） | 100 |
|
混勻，8000g，25℃離心 10min，取上清液
3、定磷（在EP 管或 96 孔板中加入下列試劑）
| 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液（μl） |
| 20 |
|
|
上清液（μl） |
|
| 20 | 20 |
蒸餾水（μl） | 20 |
|
|
|
定磷試劑（μl） | 200 | 200 | 200 | 200 |
混勻，室溫放置 30min，在 660nm 處，記錄各管吸光值。
注意：
1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照，本試劑盒 100 管保證測(cè) 48 份P5CS 活性。
2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷。
3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
計(jì)算：
1、血清（漿）P5CS 活力的計(jì)算:
單位定義：每小時(shí)每毫升血清（漿）中P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
P5CS 活力（μmol/h/ml）=C 標(biāo)準(zhǔn)管×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）×V 總÷V 樣÷T=9
×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）
2、組織中P5CS 活力的計(jì)算：
（1） 按蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中 P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
P5CS 活力(μmol/h /mg prot)=C 標(biāo)準(zhǔn)管×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）×V 總÷（Cpr×V樣）÷T =9 ×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每小時(shí)每克組織中 P5CS 消耗ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
P5CS 活力(μmol/h /g 鮮重)=C 標(biāo)準(zhǔn)管×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）×V 總÷(W× V
樣÷V 樣總)÷T=9 ×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/ml；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.3ml；V 樣：加入樣本體積，0.1ml ； V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1/6 小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重， g。
