一、實驗背景與目的  

腦類器官作為模擬人腦結(jié)構(gòu)和功能的體外三維模型，在神經(jīng)發(fā)育、疾病機制和藥物篩選研究中具有重要價值。然而，傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)存在營養(yǎng)物質(zhì)梯度不均、氧合受限等問題，影響類器官的成熟度和功能性。北京基爾比生物科技公司開發(fā)的微重力三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)通過模擬微重力環(huán)境，可顯著改善細胞外基質(zhì)分布、促進細胞間相互作用，并減少剪切力損傷，為腦類器官的高效培養(yǎng)提供了創(chuàng)新解決方案。  

本實驗方案旨在利用北京基爾比生物公司研制的微重力三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 【如 Clinostat, Beijing Kilby】培養(yǎng)腦類器官，評估其在微重力環(huán)境下的生長特性、細胞組成及功能表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)對比，驗證其技術(shù)優(yōu)勢。

二、實驗材料  

1. 細胞來源：人誘導多能干細胞（iPSCs，如IMR90-4株）。  

2. 培養(yǎng)試劑：  

  - 神經(jīng)誘導培養(yǎng)基（含LDN-193189、SB431542、XAV939等小分子抑制劑）。  

  - 神經(jīng)分化培養(yǎng)基（含B27、N2、BDNF、cAMP等）。  

3. 微重力培養(yǎng)系統(tǒng)：北京基爾比生物科技三維旋轉(zhuǎn)生物反應器（如 Clinostat, Beijing Kilby參數(shù)：轉(zhuǎn)速5 rpm，傾角10°，37℃恒溫，5% CO?）。  

4. 檢測工具：  

  - 活細胞成像系統(tǒng)（如Nikon Eclipse Ti2）。  

  - qPCR儀、Western blot設(shè)備、LC-MS/MS（用于神經(jīng)遞質(zhì)分析）。  

三、實驗步驟  

1. 腦類器官的制備與微重力培養(yǎng)

- 階段1：神經(jīng)誘導（0-10天）

 - 將iPSCs以2×10? cells/well接種于U型低吸附96孔板，使用神經(jīng)誘導培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，每2天換液。  

 - 微重力組：第5天轉(zhuǎn)移至微重力生物反應器，持續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（5 rpm）。  

- 階段2：神經(jīng)分化（10-120天）

 - 將類器官轉(zhuǎn)移至6孔板，使用神經(jīng)分化培養(yǎng)基（NDM-I），微重力組維持旋轉(zhuǎn)條件。  

 - 第18天后更換為含維生素A的NDM-II培養(yǎng)基，添加BDNF和cAMP，每4天換液。  

2. 微塑料（MP）暴露實驗

- 參考Park et al. (2025)方法，將50 nm和100 nm熒光標記MP（10 mg/mL）加入培養(yǎng)基，處理21天，評估MP滲透深度及毒性。  

3. 檢測與分析

3.1 形態(tài)學評估：  

 - 激光共聚焦顯微鏡觀察類器官結(jié)構(gòu)（如神經(jīng)元層、腦室樣區(qū)域）。  

 - 免疫熒光染色（標記PAX6、SOX2、TUJ1、GFAP等）。  

3.2 功能分析：  

 - qPCR：檢測神經(jīng)發(fā)育基因（如FOXG1、OTX2）及凋亡相關(guān)基因（BAX、BCL-2）。  

 - Western blot：分析凋亡標志物（cleaved caspase-3）及突觸蛋白（Synapsin-1）。  

 - 神經(jīng)遞質(zhì)檢測：LC-MS/MS定量谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）等。  

- 微重力效應驗證：  

 - 對比靜態(tài)培養(yǎng)組，評估類器官直徑、細胞存活率（CellTiter-Glo® 3D試劑）及氧消耗率（Seahorse分析儀）。  

四、預期結(jié)果  

1. 微重力組腦類器官呈現(xiàn)更均勻的細胞分布、更大的體積（>500 μm）及更成熟的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。  

2. MP暴露實驗中，50 nm MP在微重力條件下滲透更深（>300 μm），但凋亡率顯著低于靜態(tài)培養(yǎng)組（微重力可能緩解MP毒性）。  

3. 神經(jīng)遞質(zhì)分泌譜顯示微重力組Glu/GABA比例更接近體內(nèi)水平。  

五、應用前景  

北京基爾比生物公司研制的微重力三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 【如 Clinostat, Beijing Kilby】可優(yōu)化腦類器官的仿生性，適用于：  

- 神經(jīng)毒性研究：如環(huán)境污染物（MP、重金屬）的作用機制。  

- 疾病建模：阿爾茨海默病、自閉癥類器官的長期培養(yǎng)。  

- 藥物篩選：高通量測試神經(jīng)保護劑的療效。  

附：關(guān)于發(fā)布“腦科學與類腦研究"國家科技重大專項2025年度項目申報指南的通告

一、資助模式

申報單位應根據(jù)指南方向的研究內(nèi)容和考核指標以項目形式組織申報，項目分為常規(guī)項目和青年科學家項目，項目執(zhí)行期一般為5年。

（一）常規(guī)項目。

指南方向1-11為常規(guī)項目。

常規(guī)項目可下設(shè)課題，應整體申報，并覆蓋相應指南方向的全部研究內(nèi)容和考核指標。除特殊說明外，每個常規(guī)項目下設(shè)課題數(shù)不超過4個，項目（課題）牽頭單位和參與單位總數(shù)不超過7家。常規(guī)項目設(shè)1名負責人，每個課題設(shè)1名負責人，項目負責人可擔任其中1個課題的負責人，項目（課題）負責人和項目骨干不多于8人。

常規(guī)項目每個指南方向原則上只支持1項，僅在申報項目評審結(jié)果相近、技術(shù)路線明顯不同時，可同時支持2項，并建立動態(tài)調(diào)整機制，根據(jù)中期評估結(jié)果擇優(yōu)繼續(xù)支持。

（二）青年科學家項目。

指南方向12-25為青年科學家項目。

青年科學家項目分為A類與B類兩種支持方式，其中A類申請國撥經(jīng)費不超過500萬元，B類申請國撥經(jīng)費不超過300萬元。青年科學家項目申報不需要覆蓋指南方向的全部研究內(nèi)容。每個項目牽頭單位和參與單位總數(shù)不超過2家，鼓勵學科交叉和聯(lián)合申報。指南方向下設(shè)2個課題，兩位課題負責人的研究方向應屬于腦認知原理解析、腦重大疾病研究、腦機接口、類腦計算等方向中的任何兩個不同方向。青年科學家項目每個指南方向支持的項目數(shù)量將根據(jù)申請情況確定。申請青年科學家項目的項目（課題）負責人可根據(jù)所發(fā)布的指南方向，結(jié)合自身的研究需求，選擇提出A類或B類申請。

北京基爾比生物公司主營產(chǎn)品：

Kilby 3D-clinostat 三維旋轉(zhuǎn)儀，

Kilby 微/超重力三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，

3D回轉(zhuǎn)重力環(huán)境模擬系統(tǒng)，隨機定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

英國Kirkstall 類器官串聯(lián)芯片灌流仿生構(gòu)建系統(tǒng)