免疫沉淀中的高背景無法避免？

一定要對樣品溶液進行預(yù)清除？

更高的結(jié)合能力對免疫沉淀更好？

高質(zhì)量的磁珠價格昂貴？

免疫沉淀實驗想必大家并不陌生，采用瓊脂糖珠作為介質(zhì)更是免疫沉淀的常用方法。瓊脂糖珠介質(zhì)歷來有一些難以克服的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致人們對免疫沉淀持有一些并非總是正確的普遍看法。如何能讓免疫沉淀實驗事半功倍，自然需要對 “四大誤解"有深入了解。

誤解1：背景是不可避免的

 

要理解這個“誤解"，首先需要知道什么是背景以及它的來源。免疫沉淀實驗中的背景是一種額外的非特異性信號，與抗原或相關(guān)蛋白質(zhì)的質(zhì)量大小不一致。背景主要由兩個原因引起：1) 未將上清液與顆粒/樹脂或珠子清晰分離；2) 瓊脂糖或 Sepharose 樹脂的孔隙。當使用Sepharose或瓊脂糖樹脂的混懸液法時，是沒有明確沉淀物的。因此，研究人員可能會意外地去除過多的混懸液（和寶貴的樣品），或者去除不足，導(dǎo)致樣品中含有可能提升背景的不需要的蛋白質(zhì)。多孔的Sepharose/瓊脂糖樹脂會吸附液體，以及不需要的蛋白質(zhì)。即使進行了多次洗滌，仍然很難去除干擾性蛋白質(zhì)，導(dǎo)致背景較高。

小貼士：如何減少免疫沉淀中的背景

Dynabeads磁珠可以被磁化，與磁力架一起使用時，可輕松將其拉到樣品管的一側(cè)。這一特點使得移除緩沖液或上清液變得非常容易，不會造成任何破壞或樣品損失。

Dynabeads磁珠的一個關(guān)鍵特點是其表面清晰，沒有孔隙。所有的結(jié)合都發(fā)生在外表面，從而防止任何不需要的蛋白質(zhì)被困在內(nèi)部。

為了進一步減少免疫沉淀中的背景，建議洗滌含有感興趣蛋白質(zhì)的磁珠，以去除任何不需要的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。

圖1. 用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A 磁珠與其他供應(yīng)商的對比。進行Western blot來比較使用1）Sepharose離心柱、2）Sepharose混懸液、3）瓊脂糖混懸液和離心柱、4）樹脂離心柱、5）Dynabeads Protein A磁珠的方案時間和背景的差異（每種方法一式兩份）。Dynabeads Protein A磁珠的免疫沉淀具有低背景且至少節(jié)省14分鐘的時間。

誤解2：為獲得高質(zhì)量的免疫沉淀結(jié)果，必須對樣品溶液進行預(yù)清除

 

這個誤解認為，非目標蛋白的其他蛋白質(zhì)可能會與固相發(fā)生非特異性結(jié)合。為了解決這個問題，通常會進行預(yù)清除步驟，即將固相（不含抗體）加入樣品中一段時間，然后移除，以去除不需要的非特異性蛋白質(zhì)和背景。然而，進行免疫沉淀的預(yù)清除步驟需要使用雙倍量的固相，并增加了整個免疫沉淀方案所需的時間。

小貼士：無需預(yù)清除樣品溶液，即可避免背景干擾

使用 Dynabeads 磁珠與特異性抗體偶聯(lián)后，無需預(yù)清除，因為它并不識別非特異性蛋白質(zhì)。這種方法不僅節(jié)省了一半的固相使用量，還減少了實驗所需時間。

圖2. 不進行預(yù)清除的Dynabeads  Protein G磁珠與進行預(yù)清除的Sepharose Protein G珠之間的背景水平比較。進行Western blot來比較兩種方法的背景水平，1）進行預(yù)清除的Sepharose Protein G珠和2）不進行預(yù)清除的Dynabeads Protein G磁珠（每種方法的樣品一式八份）。結(jié)果顯示，使用Dynabead Protein G磁珠進行免疫沉淀能始終沉淀出更多的相關(guān)蛋白。

誤解3：更高的結(jié)合能力對免疫沉淀更好

 

這個誤解是基于瓊脂糖和Sepharose珠子的抗原結(jié)合能力。瓊脂糖和Sepharose珠子具有外表面和內(nèi)表面，蛋白質(zhì)可以結(jié)合的區(qū)域很大，從而導(dǎo)致高結(jié)合能力。這種高結(jié)合能力意味著這些珠子和樹脂也可以與樣品中的其他蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合。研究人員在選擇IP技術(shù)時需要在結(jié)合能力、產(chǎn)量、特異性和成本之間取得平衡。

小貼士：平衡結(jié)合能力、產(chǎn)量和特異性

可以使用磁珠，磁珠外表面與能識別相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合。由于使用柱式免疫沉淀方法以外的免疫沉淀只需要1-10 µg的抗體，因此并不需要高結(jié)合能力的試劑，而且成本效益不高。只需使用實驗所需的確切量即可，這樣可以節(jié)省實驗室的抗體、試劑和免疫沉淀磁珠。

誤解4：高質(zhì)量的磁珠價格昂貴

 

研究人員可能會認為Dynabeads磁珠價格昂貴，而瓊脂糖/ Sepharose混懸液則更具成本效益。然而，如果考慮到磁珠不需要預(yù)清除步驟，那么每個樣品的價格是相當?shù)模踔量赡芨汀?/p>

在計算免疫沉淀的成本時，研究人員可能會考慮固相的成本與固定體積固相的結(jié)合能力。然而，正如我們在誤解3中了解到的，固相的高結(jié)合能力對于免疫沉淀實驗并不關(guān)鍵，可能是多余的，導(dǎo)致使用更多昂貴的抗體。

小貼士：計算使用 Dynabeads 磁珠節(jié)省的成本

計算免疫沉淀成本的正確方法是查看進行一次免疫沉淀所需的磁珠和抗體的用量。由于瓊脂糖/ Sepharose混懸液通常需要預(yù)清除，因此這些珠子的成本必須加倍。由于Dynabeads磁珠具有較少的非特異性結(jié)合且不需要預(yù)清除，因此在免疫沉淀實驗中使用Dynabeads磁珠比使用瓊脂糖/ Sepharose珠更具成本效益。

可以說，利用磁珠的免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展幫助科學(xué)界克服了關(guān)于免疫沉淀的特定誤解，從而為需要優(yōu)化其免疫沉淀實驗的科學(xué)家提供了支持。

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