將細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化提升一個新高度

引言

目前，細(xì)胞培養(yǎng)操作中持續(xù)存在的質(zhì)量和可重復(fù)性問題仍是重大挑戰(zhàn)，導(dǎo)致生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中時間和寶貴資源的浪費(fèi)。自動化通過顯著提升可追溯性、標(biāo)準(zhǔn)化并減少人為錯誤，有效降低了當(dāng)前可重復(fù)性危機(jī)背后的風(fēng)險。Hamilton Cell Care STAR專為標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞維護(hù)工作流程而設(shè)計(jì)，確保細(xì)胞在每周的每一天都能以相同且可重復(fù)的方式進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和記錄通過Cell Control軟件進(jìn)行報告；該軟件提供用戶友好的界面，并在后臺管理多種不同的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用。在此，我們展示了基于Cell Control軟件兩種工作流程（工作步驟）的細(xì)胞培養(yǎng)自動化優(yōu)勢：“擴(kuò)增"和“接種"。通過多種可調(diào)節(jié)參數(shù)，這些操作步驟使用戶能夠?qū)蝹€24孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞擴(kuò)增到多個24孔目標(biāo)板中，或?qū)⑵浣臃N到96孔板中以設(shè)置實(shí)驗(yàn)。

與手動操作相比，自動化細(xì)胞接種和擴(kuò)增在24孔板和96孔板格式中均顯著降低了孔間變異性。標(biāo)準(zhǔn)化方法（“工作步驟"）和參數(shù)可調(diào)整且可追溯，確保實(shí)驗(yàn)的一致性。用戶友好的Cell Control軟件只需點(diǎn)擊幾下即可進(jìn)行調(diào)度，并提供可靠的時間和資源管理，將用戶干預(yù)降低。

24孔板擴(kuò)增

圖：24孔板擴(kuò)增工作流程。將24孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞脫落并轉(zhuǎn)移至多個（2-20個）24孔目標(biāo)板中，轉(zhuǎn)移比例由用戶自定義，隨后進(jìn)行全自動成像和數(shù)據(jù)分析。

24孔板接種

圖：24孔板接種工作流程。將24孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞脫落并轉(zhuǎn)移至多個（2-20）96孔目標(biāo)板中，其中24孔板的1個孔對應(yīng)96孔目標(biāo)板的4個孔。使用用戶定義量的細(xì)胞懸液進(jìn)行接種，隨后進(jìn)行全自動成像和數(shù)據(jù)分析。

向自動化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)過渡不僅僅意味著優(yōu)化細(xì)胞自動化工作流程——Cell Care STAR確保了高度的一致性和自主性，從而將細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化提升到了一個新的水平。

HeLa細(xì)胞（Sigma-Aldrich，93021013）在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下在補(bǔ)充有10%FBS（Gibco，A5256801）的高糖DMEM（Gibco）（L0101-500）中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前一天，使用Cell Care STAR工作步驟“從槽中接種"將細(xì)胞接種到條形碼的24孔板（Greiner，662160）中，并使用Cytation 1成像儀和Gen5軟件（安捷倫）的細(xì)胞分析工具確定細(xì)胞融合。僅選擇細(xì)胞融合為60%至80%的培養(yǎng)板用于實(shí)驗(yàn)。整個“擴(kuò)增"和“接種"過程在Cell Care STAR系統(tǒng)上自動完成，而為了進(jìn)行比較評估，該過程由一位經(jīng)驗(yàn)豐富的操作員手動完成。HeLa細(xì)胞用PBS（Fisher Scientific，153736631）洗滌一次，然后在+37°C下用0.05%胰蛋白酶-EDTA（Fisher Sciences，25300104）分離4分鐘，然后在1000 rpm下振蕩2分鐘。胰蛋白酶用兩倍體積的培養(yǎng)基中和，細(xì)胞懸浮液通過移液混合。對于細(xì)胞擴(kuò)增，將一個24孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到五個24孔板中，分裝比例為1:5。在細(xì)胞接種時，將50μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到每個孔中，共使用三個96孔板（Thermo Fisher,181736）。手動操作時使用多通道移液器，條件與上述相同。

Cell Control 軟件

Hamilton Cell Control軟件是專門為在幾天或幾周內(nèi)自主管理復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)維護(hù)工作流程而開發(fā)的。其直觀易用的界面支持通過簡單點(diǎn)擊即可完成批次設(shè)置（包含多個操作步驟）、試劑補(bǔ)給以及消耗量估算等功能。每個工作步驟均包含一組可調(diào)整的參數(shù)（例如胰蛋白酶孵育時間、傳代比例、培養(yǎng)基體積等），可根據(jù)不同細(xì)胞系的特性進(jìn)行精細(xì)調(diào)整。

圖:Hamilton Cell Control軟件的概述選項(xiàng)卡，突出顯示了其主要功能。

圖：Hamilton Cell Control軟件的批次概述界面。每個批次的工作步驟均可單獨(dú)安排，且每個步驟均包含一組可調(diào)整的參數(shù)。

技術(shù)

Cell Care STAR配備二級生物安全柜，確保樣本、人員及環(huán)境的安全。其集成的細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)板儲存系統(tǒng)及溫度可控的臺面儲存空間（例如+10至+40°C）可存儲試劑和培養(yǎng)板，提供自主操作。該設(shè)備配備兩個傾斜模塊和兩個加熱震蕩器，可同時處理兩個細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞脫落過程可定制，使細(xì)胞傳代操作能夠適應(yīng)不同細(xì)胞系的需求。集成的Agilent Cytation 1 Reader和Gen5軟件允許設(shè)置用戶定義的分析方法，用于基于細(xì)胞的檢測和生長監(jiān)測。通過 Hamilton Cell Control軟件，可輕松安排工作流程，該軟件提供用戶友好的界面，實(shí)現(xiàn)快速高效的流程規(guī)劃。該軟件內(nèi)置11種預(yù)先編程、測試并驗(yàn)證的即用型方法，適用于6孔、24孔和96孔板格式。Cell Care STAR使用戶能夠以自動化、可追溯和可調(diào)節(jié)的方式進(jìn)行一般的細(xì)胞培養(yǎng)維護(hù)和準(zhǔn)備大規(guī)模實(shí)驗(yàn)（例如基于細(xì)胞的檢測），并且具有非常高的標(biāo)準(zhǔn)化水平。使用AutoStart功能，可以最大限度地延長無人值守時間，使周末工作變得不必要。

結(jié)果

將HeLa細(xì)胞擴(kuò)增到五個24孔板中或接種到三個96孔板上，并使用來自不同傳代的細(xì)胞在三個生物復(fù)制品中測量細(xì)胞融合度。為了評估重復(fù)性，計(jì)算了同一培養(yǎng)板內(nèi)不同孔位之間細(xì)胞融合度的變異系數(shù)（CV），以及不同培養(yǎng)板之間平均細(xì)胞融合度的變異系數(shù)（CV）。Cell Care STAR系統(tǒng)進(jìn)行的自動化細(xì)胞培養(yǎng)操作與經(jīng)驗(yàn)豐富的操作員進(jìn)行的手動處理相比，在將細(xì)胞擴(kuò)增至24孔板（p<0.05）和接種至96孔板（p<0.001）時，孔間變異性顯著降低。目標(biāo)板之間平均細(xì)胞融合的CV值相當(dāng)，且在自動化操作與手動操作之間無顯著差異。

擴(kuò)增：從24孔擴(kuò)增至5×24孔

圖：將24孔板中的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)移至五塊24孔板中，其中兩塊使用Cell Care STAR（上）轉(zhuǎn)移，另三塊由用戶手動轉(zhuǎn)移（下），并在24小時后進(jìn)行成像（A）。圖中顯示了細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)各孔之間細(xì)胞融合度的變異系數(shù)（B）以及三組生物重復(fù)（n=3）中各板之間平均細(xì)胞融合度的變異系數(shù)（C）。***表示在采用非配對學(xué)生t檢驗(yàn)的組間比較中，p<0.001具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

接種：24孔板至3×96孔板

圖：將24孔板中的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三個96孔板中，其中一部分使用Cell Care STAR（上）轉(zhuǎn)移，另一部分由用戶手動轉(zhuǎn)移（下），并在24小時后進(jìn)行成像（A）。圖中顯示了細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)各孔之間細(xì)胞融合度的變異系數(shù)（B）以及三份生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)中各板之間平均細(xì)胞融合度的變異系數(shù)（C）（n=3）。*表示采用非配對學(xué)生t檢驗(yàn)后，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

討論/總結(jié)

基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)在制藥和生物醫(yī)學(xué)研究中的使用正在迅速擴(kuò)大，對細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)質(zhì)量和更高通量的改進(jìn)需求也在增加。Hamilton的Cell Care STAR是即用型解決方案，旨在通過優(yōu)化許多常見的細(xì)胞培養(yǎng)維護(hù)工作流程來滿足這些需求。通過利用Cell Care STAR的“擴(kuò)增"和“接種"工作步驟，我們證明了自動化能夠顯著提升細(xì)胞接種的準(zhǔn)確性，與經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員的手動操作相比，自動化可減少培養(yǎng)板內(nèi)孔間變異性。通過自動化實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量的提升，是通過精準(zhǔn)的液體處理技術(shù)，結(jié)合關(guān)鍵細(xì)胞處理步驟（如移液速度、細(xì)胞混合周期、胰蛋白酶孵育時間、細(xì)胞脫落以及細(xì)胞在培養(yǎng)箱外停留時間）執(zhí)行過程中的低變異性共同實(shí)現(xiàn)的。此外，Cell Control軟件可實(shí)現(xiàn)對所有細(xì)胞操作步驟的自動追蹤，從而幾乎杜絕實(shí)驗(yàn)或樣本混淆的可能。此外，該軟件還支持在最佳時間點(diǎn)規(guī)劃并執(zhí)行細(xì)胞維護(hù)步驟、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)置以及細(xì)胞檢測，且全程無需人工干預(yù)——無需實(shí)驗(yàn)人員在場即可完成操作，確保實(shí)驗(yàn)在需要時而非僅在方便時執(zhí)行。Cell Care STAR 能夠處理約20個細(xì)胞培養(yǎng)板，將約8個細(xì)胞培養(yǎng)板擴(kuò)增至40個，并能夠從8個細(xì)胞培養(yǎng)板中無需人工干預(yù)地接種80個96孔板，具體取決于體積設(shè)置和細(xì)胞培養(yǎng)板格式。Cell Care STAR的日程安排按照優(yōu)先級順序并根據(jù)用戶的決定在日程安排的當(dāng)天執(zhí)行工作步驟。