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NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

NADH 氧化酶試劑盒 輔酶Ⅰ

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD 的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

測定原理：

NOX 能夠?qū)?/span>NADH 氧化為NAD，NADH 的氧化與 2,6 二lu酚靛藍(lán)（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍(lán)色的DCPIP 被還原為無色的DCPIP，在 600nm 下測定藍(lán)色DCPIP 的還原速率計(jì)算出 NADH 氧化酶活性的大小。

組成：

試劑六：粉劑×2 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。將勻漿 600g，4℃離心 5min。

棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做）。

步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于NOX 活性測定。

血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

試劑四、試劑五和試劑六于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。

在 1ml 石英比色皿中加入 40μl 樣本、700μl 試劑四、100μl 試劑五和 160μl 試劑六，混勻，記錄 600nm

處 20s 時(shí)吸光值A(chǔ)1 和 1min20s 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

NOX 活力單位的計(jì)算:

1、血清（漿）NOX 活力的計(jì)算:

單位的定義：每ml 血清（漿）在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘A600 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/ml）＝ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NOX 活力的計(jì)算:

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘A600 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘A600 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 ml 反應(yīng)體系中每分鐘 A600 變化 0.01 定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1ml； V 樣：加入樣本體積，0.04ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

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