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β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

β-1,3 葡聚糖酶試劑盒 糖代謝

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其他逆境條件下，可誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA 活性測定廣泛應(yīng)用于植物病理和逆境生理研究。

測定原理：

β-1,3-GA 水解昆布多糖，內(nèi)切β-1,3-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生還原末端，通過測定還原糖生成速率來計算其酶活性。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 2ml 蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存；

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在 1.5ml EP 管中依次加入下列試劑）：

充分混勻，放入 37℃水浴 60 min

充分混勻，95℃水浴 5min（蓋緊，防止水分散失），流水冷卻，取 200μl 至微量石英比色皿或 96 孔板中， 550nm 處記錄各管吸光值A(chǔ)，如果吸光值大于 2，可以用蒸餾水稀釋后測定（計算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）， ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

β-1,3-GA 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 0.0958x -0.0192；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y 為吸光值。

2、血清（漿）β-1,3-GA 活力的計算

單位的定義：每ml 血清（漿）每小時產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h/ml)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷V1=10.438×(ΔA +0.0192)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中β-1,3-GA 活力的計算

按蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h/mg prot)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(V1×Cpr)=10.438×(ΔA +0.0192) ÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每小時產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h/g 鮮重)=[( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(W×V1÷V2)= 10.438×(ΔA +0.0192) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h /104 cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0958×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0208×(ΔA+0.0192)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.035ml；V2：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 0.0479x -0.0192；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml），y 為吸光值。

2、血清（漿）β-1,3-GA 活力的計算

單位的定義：每ml 血清（漿）每小時產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h/ml)=[( ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷V1=20.876×(ΔA +0.0192)

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中β-1,3-GA 活力的計算

按蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h/mg prot)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(V1×Cpr)=20.876×(ΔA +0.0192) ÷Cpr

按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每小時產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h/g 鮮重)= [(ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(W×V1÷V2)= 20.876×(ΔA +0.0192) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為一個酶活性單位。

β-1,3-GA(mg/h /104 cell)= [( ΔA +0.0192)÷0.0479×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0416×(ΔA+0.0192)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.035ml；V2：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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