FDH 在細(xì)胞甲醛代謝與癌癥耐藥研究中被高頻引用，實(shí)驗(yàn)成敗往往取決于操作細(xì)節(jié)而非試劑本身。下面把一份 96 孔板實(shí)驗(yàn)拆成 6 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)給出可落地的動(dòng)作指令與常見(jiàn)故障排查，照著做能把板間 CV 壓到 5% 以下。

樣本制備：裂解液離子強(qiáng)度決定回收率

RIPA 高鹽配方（150 mM NaCl）會(huì)抑制 FDH 活性 20–30%，改用 50 mM Tris-HCl + 0.1% Triton X-100 可把回收率拉回 95%。細(xì)胞刮下來(lái)后先 PBS 洗兩遍，去掉培養(yǎng)基殘留的甲醛，再按 10? cells/mL 加入裂解液，冰上 15 min 后 12 000 g 離心 10 min，取上清立即上機(jī)或液氮速凍。裂解液里加 1 mM DTT 可穩(wěn)定酶活 48 h，但不要加 EDTA，它會(huì)螯合 FDH 所需的 Zn2?。

反應(yīng)體系：乙醛替代甲醛為何更穩(wěn)

試劑盒說(shuō)明書(shū)常寫(xiě)“底物甲醛終濃度 5 mM"，實(shí)際操作中 37 °C 下甲醛揮發(fā)損失 10–15%，導(dǎo)致吸光度漂移。改用乙醛 2 mM 做替代底物，Km 值與甲醛接近，揮發(fā)可忽略，線性窗口從 10 min 延長(zhǎng)到 30 min。NAD? 濃度固定在 1 mM，pH 9.0 的甘氨酸-NaOH 緩沖液能把 Vmax 推高 1.4 倍，適合低表達(dá)樣本。

板布局：空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、抑制孔如何排布

• 空白孔：裂解液 + 緩沖液 + NAD?，無(wú)乙醛，用來(lái)扣背景

• 標(biāo)準(zhǔn)孔：純化 FDH 梯度 0–0.2 U/mL，做標(biāo)曲

• 抑制孔：樣本 + 5 mM 甲酸鈉，驗(yàn)證信號(hào)特異性

每塊板至少留出 4 個(gè)空白孔，分布在四角，避免邊緣效應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)孔做雙列排布，一條用于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，另一條封膜 4 °C 保存 24 h 內(nèi)復(fù)測(cè)，驗(yàn)證板間穩(wěn)定性。

讀板參數(shù)：振蕩延遲與雙波長(zhǎng)校正

酶標(biāo)儀設(shè) 340 nm 檢測(cè) NADH 生成，動(dòng)力學(xué)模式讀 5 min，間隔 15 s。加乙醛啟動(dòng)反應(yīng)后延遲 30 s 再開(kāi)始讀數(shù)，讓液體表面張力穩(wěn)定。開(kāi)啟 405 nm 參比波長(zhǎng)，扣除氣泡或纖維蛋白造成的散射。若使用 384 孔小體系，把振蕩幅度降到 1 mm，防止液體飛濺。

故障排查：信號(hào)漂移與負(fù)值出現(xiàn)

信號(hào)漂移 90% 由揮發(fā)或溫度不均導(dǎo)致。把板蓋換成透氣膜，37 °C 預(yù)熱 5 min 再上機(jī)。出現(xiàn)負(fù)值通常是空白孔 OD 高于樣本孔，檢查空白孔是否誤加乙醛，或裂解液里混入了細(xì)胞碎片。重新離心 5 min 可解決。

數(shù)據(jù)換算：蛋白歸一與細(xì)胞歸一并用

一張 96 孔板跑完，先用 BCA 測(cè)每孔總蛋白，把 U/mL 轉(zhuǎn)成 U/mg。再用同一孔的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀讀數(shù)，得到 U/10? cells。兩者比值可判斷樣本裂解效率：比值 <0.5 提示裂解不全，需延長(zhǎng)裂解時(shí)間或加大 Triton 濃度。