梯度洗脫是指在同一個(gè)分析周期中隨著時(shí)間的變化按一定程序梯度性地改變洗脫液的比例(濃度配比、成分、離子強(qiáng)度、溶液極性等)或pH，以期將層析柱上不同的組分洗脫出來(lái)的方法。從而可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)（極性）差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達(dá)到良好的分離目的。梯度洗脫一般分為二元高壓梯度，二元低壓梯度和四元低壓梯度；二元高壓梯度需要兩臺(tái)高壓泵，二元低壓梯度和四元低壓梯度都是只需要一臺(tái)高壓泵和一個(gè)比列閥。

梯度洗脫的原理

具體地講，當(dāng)樣品隨梯度起點(diǎn)的流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱入口時(shí)，由于起點(diǎn)流動(dòng)相中弱洗脫溶劑A含量較高，強(qiáng)洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適中)和化合物C2(保留較強(qiáng))因分配系數(shù)(k值)較高而滯留于色譜柱入口附近，幾乎未移動(dòng)。一段時(shí)間后，B增加到一定數(shù)值，C1的k值達(dá)到足夠小(比如小于10)，其在柱中的移動(dòng)速率明顯增大，并且隨著B的增加，其移動(dòng)速率愈加快速，直到tC1時(shí)流出色譜柱，被檢測(cè)器檢測(cè)到并被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時(shí)的保留時(shí)間長(zhǎng)很多，但C1的的平均k值卻很小，因而色譜峰并未展寬，靈敏度仍處于較高水平。B持續(xù)增加，在隨后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)，C2的k值也降到10以下，C2的移動(dòng)速率也開(kāi)始變快，以與C1類似的方式于tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣很小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處于較高水平。

流動(dòng)相的梯度變化即流動(dòng)相極性、PH值等的梯度變化，即洗脫能力成梯度變化。

洗脫要求

1.洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使各峰*或基本分離；

2.梯度的上限（強(qiáng)洗脫溶劑的比例）要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來(lái)。

3.梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng)的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過(guò)早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過(guò)晚解吸會(huì)使峰形過(guò)寬。