目的：采用液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，為用于臨床研究血漿中雌二醇和睪酮的定量分析，開發(fā)靈敏的 LC-MS/MS 分析方法。

簡(jiǎn)介：對(duì)用于臨床研究血漿樣品中雌二醇和睪酮的定量分析要求具有靈敏的分析方法。液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)因其是一種高靈敏度和寬選擇性的分析技術(shù)，現(xiàn)已被廣泛用于對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品的雌二醇和睪酮的分析中，如人體血清或血漿。

實(shí)驗(yàn)：樣品制備為制備樣品，先將 10 µL 的加標(biāo)溶液（終濃度范圍：0.5-10 ng/mL）和 20 µL 的內(nèi)標(biāo)化合物（2 ng/mL 睪酮 -13C3 和 20 ng/mL 雌二醇 -d5）加入到 400 µL 的血漿中。然后再加入 2 mL 的 MTBE，對(duì)樣品溶液進(jìn)行渦旋。在進(jìn)行液 – 液萃?。↙LE）之后 對(duì) MTBE 層進(jìn)行氮吹，氮吹后加入 200 µL 50：50 甲醇 / 水重新建立分層。取 10 µL 進(jìn)樣進(jìn)行 LCMS/MS 分析，每個(gè)樣重復(fù)進(jìn)樣三次。

液相色譜分析方法：采用 Thermo ScientificTM VanquishTM Flex HPLC 系統(tǒng)并配備 Thermo ScientificTM AccucoreTM aQ C18 極性 LC 色譜柱（100×2.1 mm，2.5 µm 粒徑，P/N 17326-102130）進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相 A 和 B 分別為 0.5 mM 的氟化銨水溶液和純甲醇溶液，溶劑分別為 Fisher ChemicalTM OptimaTM 級(jí)水和純甲醇。柱溫箱溫度設(shè)為 40 ° C，總運(yùn)行時(shí)間為 9 分鐘（表 1）。

質(zhì)譜分析方法：質(zhì)譜方法采用配置加熱式電噴霧離子源（HESI）的 Thermo ScientificTM TSQ AltisTM 三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行 分析。表 2 顯示了質(zhì)譜儀的離子源參數(shù)。

對(duì)雌二醇、睪酮及其同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)化合物分析時(shí)采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）離子對(duì)，以提供離子比率確認(rèn)（IRC）。在分時(shí)選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（t-SRM）模式下進(jìn)行掃描，循環(huán)時(shí)間為 0.4 秒。表 3 顯示了在本次分析中所使用的 SRM 相關(guān)參數(shù)信息。

數(shù)據(jù)分析：采用 Thermo ScientificTM TraceFinderTM 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理。

結(jié)果和討論：雌二醇和睪酮的定量下限（LLOQ）被定義為根據(jù)線性校正曲線反算所得到的校正物濃度不超過(guò)理論值的 20％、離子比率在目標(biāo)物 20% 范圍內(nèi)，且重復(fù)進(jìn)樣計(jì)算所得的 %RSD 小于 20% 時(shí)的低濃度。血漿中睪酮的 LLOQ 為 2 pg/mL - 20 fg（線性范圍為：2-1000 pg/mL - 圖 1），血漿中雌二醇的 LLOQ 為 20 pg/mL - 200 fg（線性范圍為：20-10,000 pg/mL - 圖 2）。對(duì)于所有濃度重復(fù)進(jìn)樣的樣品而言，睪酮和雌二醇的精密度分別小于 8% 和 7%

結(jié)論：TSQ Altis 三重四極桿質(zhì)譜儀為血漿中的雌二醇和睪酮的臨床定量分析研究提供了的靈敏度。在該篇技術(shù)文摘所描述的方法中，當(dāng)采用該方法測(cè)定血漿中的睪酮和雌二醇時(shí)，定量限分別為 20 pg/mL（柱上進(jìn)樣 200 fg）和 2 pg/mL（柱上進(jìn)樣 20 fg）。

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