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前兩期中，我們分別介紹了Orbitrap Exploris™ 480的設(shè)計(jì)原則和硬件性能，的定性能力，F(xiàn)AIMS Pro可選組件以及對(duì)TMT定量的改進(jìn)。本期，飛飛將為您展示Orbitrap Exploris™ 480絢爛的一筆——

豐富的定量流程

BoxCar,  SureQuant定量流程

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，只適用于發(fā)現(xiàn)階段的數(shù)據(jù)依賴采集模式（Data Dependent Acquisition, DDA; 例如非標(biāo)記定量，SILAC, TMT, 穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記等定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法都屬于這一范疇）已經(jīng)不能*跟上日益提高的分析需求，尤其是針對(duì)臨床大隊(duì)列的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。而隨后發(fā)展的DIA?¹?, PRM?²?等靶向或者擬靶向技術(shù)則進(jìn)一步*基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的隔閡。

Orbitrap Exploris™ 480對(duì)于上述涉及的所有定量方法都給出了非常完善的支持，除此之外Orbitrap Exploris™ 480上的兩個(gè)新的定量方法也極大的豐富了現(xiàn)有的定量流程。

2018年Matthias實(shí)驗(yàn)室在Nature Methods上發(fā)表了全新的BoxCar的采集方式（圖1）。

圖1.BoxCar采集方式示意（點(diǎn)擊查看大圖）

BoxCar采集方法的核心思想在于一級(jí)全掃時(shí)采用分段累積，合并掃描的multi-plexing full scan來(lái)規(guī)避在同一張full scan中高豐度肽段對(duì)于低豐度肽段的信號(hào)壓制，從而提升一級(jí)全掃的動(dòng)態(tài)范圍和觸發(fā)二級(jí)的靈敏度。

并且借助MaxQuant軟件的“Match Between Runs”功能，還可以使用一級(jí)質(zhì)譜feature的質(zhì)核比和保留時(shí)間來(lái)進(jìn)行不依賴于二級(jí)鑒定的定量模式。BoxCar的采集模式對(duì)于動(dòng)態(tài)范圍大的樣本會(huì)有比較顯著的鑒定深度優(yōu)勢(shì)。Orbitrap Exploris™ 480對(duì)于BoxCar的采集模式提供了更好的兼容性，例如將Spectral Multiplexing從10提升至了20, 以支持更為密集的BoxCar隔離窗口。通過對(duì)未進(jìn)行高豐度蛋白去除的血漿樣品的分析我們可以看到，采用BoxCar的集采模式相較于傳統(tǒng)DDA顯著增加了肽段和蛋白的鑒定數(shù)量（圖2-(a,b,c,d)）。

圖2-(a,b,c,d) Orbitrap Exploris™ 480上使用BoxCar DDA模式對(duì)血漿樣品進(jìn)行分析（點(diǎn)擊查看大圖）

SureQuant-超高通量的PRM定量方法

平行反應(yīng)監(jiān)控（Parallel Reaction Monitoring, PRM）是Orbitrap系列儀器上的高分辨靶向定量方法，類似于三重四極桿質(zhì)譜上的選擇反應(yīng)監(jiān)控（Selected Reaction Monitoring, SRM）,其是進(jìn)行潛在標(biāo)志物驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn)方法之一。

但是PRM一直受到通量問題的困擾，即使采用動(dòng)態(tài)保留時(shí)間，也難以在一針采集中同時(shí)監(jiān)控上百條肽段。因此，在2015年Gallien等人在MCP上發(fā)表了Internal-Standard triggered PRM（IS-PRM）的方法，其核心思想為對(duì)內(nèi)標(biāo)肽段進(jìn)行一個(gè)低分辨，低離子注入時(shí)間的PRM掃描（內(nèi)標(biāo)的含量通常比較高，因此不會(huì)受到靈敏度影響），隨后在線對(duì)該P(yáng)RM掃描進(jìn)行實(shí)時(shí)譜圖檢索，若能夠匹配到目標(biāo)序列則觸發(fā)對(duì)應(yīng)內(nèi)源肽段的高分辨，高離子注入時(shí)間的PRM掃描用于定量???。該方法由于需要使用賽默飛提供的API對(duì)儀器控制軟件進(jìn)行編程修改，因此一直未能得到廣泛應(yīng)用。

而Orbitrap Exploris™ 480上則提供了商品化的，即時(shí)可用的SureQuant定量方法，其核心思想和IS-PRM類似，但是其實(shí)現(xiàn)更為巧妙和便捷。SureQuant定量流程巧妙的采用了數(shù)據(jù)依賴的采集方法來(lái)實(shí)現(xiàn)IS-PRM相同的功能（圖3）。

來(lái)看我的新方法

首先我們會(huì)進(jìn)行一個(gè)一級(jí)的全掃，然后采用inclusion list triggered MS² 來(lái)對(duì)同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽段進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的掃描（inclusion list中包含了所有需要檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)肽段），由于內(nèi)標(biāo)肽段通常都以較高的濃度摻入，因此針對(duì)內(nèi)標(biāo)肽段的二級(jí)質(zhì)譜我們會(huì)采用低分辨率和低離子注入時(shí)間來(lái)進(jìn)行, 從而盡可能的節(jié)省掃描時(shí)間。隨后我們將采集的內(nèi)標(biāo)肽段的二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行快速的在線譜圖匹配，如果能否匹配到目標(biāo)內(nèi)標(biāo)肽段序列則觸發(fā)一個(gè)針對(duì)內(nèi)源肽段的二級(jí)質(zhì)譜掃描（通過的mass shift來(lái)實(shí)現(xiàn)），而內(nèi)源肽段的濃度通常較低，因此我們采用一個(gè)高分辨率，高離子注入時(shí)間的二級(jí)掃描來(lái)盡量提升檢測(cè)的靈敏度。在SureQuant流程中，我們進(jìn)行DDA的二級(jí)掃描時(shí)不設(shè)置動(dòng)態(tài)排除，因此內(nèi)源和內(nèi)標(biāo)肽段都可以得到完整的PRM的采集譜圖。

圖3. SureQuant定量流程示意

舉個(gè)例子

我們以未進(jìn)行高豐度蛋白去除的血漿蛋白定量作為一個(gè)例子。PQ 500 kit中包含了500個(gè)血漿蛋白的重同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段，總計(jì)804條重標(biāo)肽段，可用于對(duì)血漿蛋白進(jìn)行高通量的靶向定量。采用SureQuant定量流程，我們可以通過70分鐘梯度的質(zhì)譜分析實(shí)現(xiàn)每針超過550個(gè)內(nèi)源肽段的定量，并且三針之間的檢出重復(fù)性非常之高（圖4）。定量的動(dòng)態(tài)范圍從柱上15 pmol到4amol, 跨度大于6個(gè)數(shù)量級(jí)，并且重復(fù)進(jìn)樣體現(xiàn)出了相當(dāng)高的定量重現(xiàn)性（圖5）。

圖4. 采用SureQuant定量流程對(duì)未進(jìn)行高豐度蛋白去除的血漿樣品進(jìn)行定量分析（點(diǎn)擊查看大圖）

圖5. 血漿蛋白定量的動(dòng)態(tài)范圍和重現(xiàn)性（點(diǎn)擊查看大圖）

蛋白質(zhì)組學(xué)新高度

經(jīng)過三期的介紹，我們發(fā)現(xiàn)Orbitrap Exploris™ 480質(zhì)譜儀作為全新一代Q Exactive系列旗艦機(jī)型，是一款以高性能，穩(wěn)定性和耐久性為主要考量因素的高分辨質(zhì)譜儀。，其可以滿足絕大多數(shù)蛋白組學(xué)，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和生物制藥的分析需求，并且顯著提升實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的產(chǎn)出質(zhì)量和通量。勢(shì)必將蛋白質(zhì)組學(xué)，尤其是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究推向新的高度。

參考文獻(xiàn)：

1.Bruderer, R., et al., Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.

2.Peterson, A.C., et al., Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Mol Cell Proteomics, 2012. 11(11): p. 1475-88.

3.Meier, F., et al., BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods, 2018. 15(6): p. 440-448.

4.Gallien, S., S.Y. Kim, and B. Domon, Large-Scale Targeted Proteomics Using Internal Standard Triggered-Parallel Reaction Monitoring (IS-PRM). Mol Cell Proteomics, 2015. 14(6): p. 1630-44.

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