經(jīng)典的蛋白藥物代謝分析采用配體結(jié)合實(shí) 驗(yàn)（Ligand-Binding Assay，LBA)技術(shù)，其中以 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)為代表，該技術(shù) 對(duì)設(shè)備要求低，易于操作，靈敏度高。但 ELISA方法存在一些缺陷，如：受自身抗體干 擾、定量范圍窄、非特異性結(jié)合、交叉反應(yīng)、 以及免疫原性影響等問(wèn)題。近年來(lái)備受關(guān)注 的串聯(lián)質(zhì)譜方法（LC-MS/MS），在進(jìn)行蛋白 藥物代謝分析中，可提供的選擇性，良 好的準(zhǔn)確性、性、以及寬定量范圍，并 具有開(kāi)發(fā)時(shí)間短（約幾周時(shí)間），分析通量 高與多重分析能力的特性。因此，串聯(lián)質(zhì)譜 法在蛋白藥物代謝分析中的應(yīng)用日漸增多， 并已經(jīng)形成了系統(tǒng)的分析方案，可見(jiàn)綜述論 文[1,2] 。

蛋白類(lèi)藥物代謝定量液質(zhì)分析流程如圖一。 通常情況下，起始樣品量為幾至幾百微升血 液，分析需經(jīng)過(guò)1）蛋白純化，2）酶解，3） 多肽純化，4）色譜分離，5）質(zhì)譜檢測(cè)以及6） 內(nèi)標(biāo)添加等步驟。在實(shí)驗(yàn)中，直接的分析目 標(biāo)并不是完整的蛋白藥物本身，而是它的部 分片段——多肽。受到液質(zhì)分析能力限制，分 子量大于4-5KDa的蛋白藥物需要被處理到肽段 水平，并在酶解產(chǎn)生的眾多肽段中，選擇序 列*，可特異性代表蛋白藥物的肽段——指 紋肽（Signature Peptide，SP）作為直接分析 對(duì)象(多肽類(lèi)藥物采用可直接分析的方法[3,4] )。 因此在蛋白藥物代謝液質(zhì)分析中，實(shí)際是對(duì) 指紋肽的確認(rèn)與定量，也就是說(shuō)通過(guò)指紋肽 代表蛋白進(jìn)行分析。

與小分子藥物代謝質(zhì)譜分析相同，對(duì)指紋 肽的定量，需要相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行參照。 在解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí)，通過(guò)比較摻入的內(nèi)標(biāo)肽 與蛋白本身的指紋肽相對(duì)量，并與事先建立 好的標(biāo)準(zhǔn)定量曲線對(duì)照，完成定量。內(nèi)標(biāo)肽 是被選為指紋肽的穩(wěn)定同位素標(biāo)記形式 （Stable Isotope Labeled, SIL-），內(nèi)標(biāo)肽與其 對(duì)應(yīng)的指紋肽具有相同氨基酸序列，除質(zhì)量 差別外，兩者具有相同的色譜與質(zhì)譜行為。 此方法被稱(chēng)為同位素稀釋-選擇/平行反應(yīng)監(jiān)測(cè) 質(zhì)譜法(Stable Isotope Dilution - Select/Parallel Reaction Monitoring MS, SID-SRM/PRM-MS) [5,6]

有三種內(nèi)標(biāo)肽添加方法：種是在初始 樣品中直接添加同位素標(biāo)記的蛋白形式的內(nèi) 標(biāo)（SIL-Standard Protein）；第二種是在蛋白 純化后，加入含有序列長(zhǎng)度略長(zhǎng)于指紋肽的 同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽（SIL-Winged standard Peptide）;第三種是在樣品酶解后，加入與指 紋肽序列相同的同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽（Simple SIL-Standard Peptide）。顯而易見(jiàn)，內(nèi)標(biāo)加入 的越早，其與目標(biāo)蛋白共同經(jīng)歷的處理步驟 越多，各種操作造成的影響越一致，終的 定量準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性越好。第三種Simple SILStandard Peptide是根據(jù)參照指紋肽序列合成 的，其差別僅在于內(nèi)標(biāo)肽含穩(wěn)定同位素（一 般使用C13、N15等重穩(wěn)定同位素）。添加這 種內(nèi)標(biāo)肽的成本低，但其實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性較差。 對(duì)于SIL-Winged standard Peptide形式的內(nèi)標(biāo)肽 而言，除標(biāo)記同位素外，其氨基酸序列較相 應(yīng)的指紋肽延長(zhǎng)了N及C端。這樣延長(zhǎng)的SILWinged Standard Peptide 就可以參與到酶切步

驟，因此其實(shí)驗(yàn)可靠性優(yōu)于簡(jiǎn)單穩(wěn)定同位素 內(nèi)標(biāo)。由于實(shí)驗(yàn)中往往需要至少2個(gè)以上的內(nèi) 標(biāo)肽，因此多個(gè)內(nèi)標(biāo)肽可以連續(xù)的方式合成， 形成首尾相接的形式（Concatenated Standard Peptide），可在一定程度上降低成本。在這 三種內(nèi)標(biāo)中 ，  因 為 SILStandard Protein將會(huì)與目標(biāo)蛋白經(jīng)歷*相同 的處理過(guò)程，因此可以獲得好的準(zhǔn)確性與 重現(xiàn)性。

確定指紋肽是整個(gè)分析流程的基礎(chǔ)，關(guān)鍵 的選擇因素包括：1）特異性，2）酶切過(guò)程 中產(chǎn)生速度及重現(xiàn)性，3）在整個(gè)操作過(guò)程中 的化學(xué)穩(wěn)定性，4）色譜中可保留，5）質(zhì)譜 離子化效率高，質(zhì)譜碎片質(zhì)量好。指紋肽的 選擇流程見(jiàn)圖二。

在確定指紋肽的特異性時(shí)，可使用的軟件 及數(shù)據(jù)庫(kù)工具有： PeptideAtlas 、 Skyline 、 BLAST。由于指紋肽需要在全過(guò)程保持穩(wěn)定， 因此，除序列特異性外，還需要對(duì)其氨基酸 組成進(jìn)行選擇，如不能含有不穩(wěn)定氨基酸殘 基及序列 ， 如 ： Methionine 、 Cystine 、 Tryptophan，相鄰的 Aspartic acid 與 Glycine， 在N端的 Glutamine 或 Asparagine 等。為避免 Trypsin漏切，堿性氨基酸相連的情況，如ArgArg、Arg-Lys、Lys-Lys，也要被排除。指紋肽 的長(zhǎng)度在8-15個(gè)氨基酸殘基比較合適，序列太 短難于在色譜上保留，而序列太長(zhǎng)可能會(huì)有 成本及質(zhì)譜碎裂質(zhì)量問(wèn)題。此外，由于Proline 殘基可以促進(jìn)產(chǎn)生強(qiáng)的碎片信號(hào)，因此優(yōu)先 選擇含有Proline的肽段。有一些軟件工具可以 幫助選擇指紋肽，但諸如色譜共洗脫離子抑制，酶切效率等方面的考察，仍必須通過(guò)實(shí) 驗(yàn)來(lái)進(jìn)行終確認(rèn)。指紋肽的數(shù)量需要達(dá)到2- 3個(gè)以滿足蛋白藥質(zhì)譜確證及定量。對(duì)于單抗 產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，由于其與內(nèi)源性免疫球蛋白的高 度的序列同源性，有時(shí)非常難于選出多個(gè)特 異的指紋肽。對(duì)于只可選出一個(gè)指紋肽的樣 品來(lái)說(shuō)，可主要使用這個(gè)指紋肽進(jìn)行確認(rèn)及 定量，而其它不能滿足全部要求的候選指紋 肽也可保留1-2個(gè)，作為輔助信息。

除選擇指紋肽、添加內(nèi)標(biāo)策略選擇等環(huán)節(jié) 外，蛋白純化、酶切條件優(yōu)化、肽段純化、 液相分離與質(zhì)譜分析各個(gè)環(huán)節(jié)都對(duì)終結(jié)果 的靈敏度、重現(xiàn)性有著重要的影響。蛋白純 化步驟可減少基質(zhì)干擾，提高目標(biāo)蛋白相對(duì) 濃度。在這一步可選擇技術(shù)包括：分子量過(guò) 濾，蛋白沉淀（Protein Precipitation, PP）、固相萃?。⊿olid-Phase Extraction, SPE），白蛋白 去除，以及針對(duì)含有IgG的Fc片段蛋白藥物的 Protein A親和富集。目前在酶切時(shí)，大多使用 胰蛋白酶（Trypsin），其主要步驟包括蛋白的 變性、還原、烷基化、酶切等。需要優(yōu)化的 條件包括酶切緩沖溶液，酶切時(shí)間等。多肽 富集步驟可以進(jìn)一步提高指紋肽濃度，有利 于實(shí)驗(yàn)靈敏度的提高。在蛋白藥代謝液質(zhì)分 析中，可選擇的色譜方式包括Conventional （色譜柱內(nèi)徑大于1毫米），Capillary（色譜 柱內(nèi)徑介于0.1至1毫米），以及Nano LC（納 升液相，色譜柱內(nèi)徑小于0.1毫米）三種。其 中色譜柱內(nèi)徑越大，數(shù)據(jù)的度及重現(xiàn)性 越好，但靈敏度較差。使用小內(nèi)徑色譜柱的 納升色譜的靈敏度好，但操作難度較da， 色譜分析時(shí)間較長(zhǎng)。

質(zhì)譜監(jiān)測(cè)是蛋白藥物代謝定量分析的后 一環(huán)，也是關(guān)鍵一環(huán)。目前通常采用兩類(lèi)質(zhì) 譜進(jìn)行此類(lèi)分析：三重四極桿質(zhì)譜與 四極桿 - 靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（Q - Orbitrap）。 兩種質(zhì)譜分別使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜法 （Select Reaction Monitor，SRM）與平行反應(yīng) 監(jiān)測(cè)（Parallel Reaction Monitoring，PRM）質(zhì) 譜法。三重四級(jí)桿質(zhì)譜結(jié)構(gòu)中串聯(lián)了四極桿-碰撞池-四 極桿三個(gè)主要部件。在SRM質(zhì)譜方法中：眾多 肽段經(jīng)過(guò)色譜分離、離子化后，進(jìn)入個(gè) 四極桿質(zhì)量分析器中。在這里將只允許提前 設(shè)定的，接近指紋肽質(zhì)量條件的離子通過(guò)，離子在通過(guò)后立即進(jìn)入碰撞池并發(fā)生碎裂。 產(chǎn)生的碎片將進(jìn)入后面的四極桿質(zhì)量分析器， 只有符合預(yù)先設(shè)定的符合指紋肽碎裂特點(diǎn)的 碎片離子才能通過(guò)，并終到達(dá)檢測(cè)器產(chǎn)生 質(zhì)譜信號(hào)。通過(guò)兩次質(zhì)量選擇，指紋肽信號(hào) 被從復(fù)雜的基質(zhì)中分檢出來(lái)，其強(qiáng)度被用于 定量（圖3）[5,7,8,9] 。

Q-Orbitrap型質(zhì)譜結(jié)構(gòu)與三重四級(jí)桿質(zhì)譜的主 要區(qū)別是，后端的質(zhì)量分析器改為靜電場(chǎng) 軌道阱（Orbitrap）。從信號(hào)掃描方式上看， 四極桿質(zhì)譜在點(diǎn)時(shí)間上只能掃描一個(gè)信號(hào)值， 如果想掃描多個(gè)信號(hào)，就需要在不同的信號(hào) 域間不停地反復(fù)進(jìn)行切換。而 Orbitrap 則可對(duì)進(jìn)入的所有離子同時(shí)進(jìn)行高分辨、高準(zhǔn)確檢 測(cè)。這是其質(zhì)譜方法被稱(chēng)為平行離子監(jiān)測(cè)的 原因（圖3）。三重四級(jí)桿進(jìn)行SRM的主要特點(diǎn)是可 進(jìn)行超高頻率的低分辨掃描；而Q-Orbitrap進(jìn) 行的PRM方法特點(diǎn)為可進(jìn)行高準(zhǔn)確、高分辨掃 描，但掃描頻率一般。

Amelia等詳盡地對(duì)比了SRM與PRM的各項(xiàng) 性能[6] 。其中，在靈敏度、定量線性、重現(xiàn)性 等方面兩者沒(méi)有差別，但PRM在選擇準(zhǔn)確性與 定量范圍上優(yōu)于SRM，而SRM在定量精度上有 優(yōu)勢(shì)?？傮w比較，而兩者在定量能力上基本 一致。但如果從實(shí)驗(yàn)流程的角度看，基于QOrbitrap的PRM方法還具*的優(yōu)點(diǎn)：PRM方 法開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、時(shí)間短。這是因?yàn)镾RM方法僅可 允許個(gè)別碎片離子進(jìn)入檢測(cè)器，為了得到好的效果，需要對(duì)所有候選的碎片進(jìn)行選擇 優(yōu)化。而PRM在檢測(cè)中一次性記錄了全部的碎 片離子，省略了挑選碎片離子的方法開(kāi)發(fā)過(guò) 程[6] ，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)了定性與定量。還特別需要 指出的是，Q-Orbitrap具有超高分辨優(yōu)勢(shì)，背 景基質(zhì)越復(fù)雜，其抗噪音能力越強(qiáng)于三重四級(jí)桿質(zhì) 譜[6] 。顯而易見(jiàn)，因?yàn)楫?dāng)背景雜質(zhì)復(fù)雜程度加 大時(shí)，近似內(nèi)標(biāo)肽段特性的干擾雜質(zhì)將越多， 而三重四級(jí)桿質(zhì)譜只具備單位分辨能力（約幾百ppm 分辨能力），其對(duì)雜質(zhì)的過(guò)濾作用就遠(yuǎn)不如 具有高分辨能力的Orbitrap（小于5ppm分辨） 質(zhì)量分析器。

此外，由于Q-Orbitrap為超高分辨串聯(lián)質(zhì) 譜，因此，除了可對(duì)特定多肽進(jìn)行定量分析 外，對(duì)于完整蛋白分子量測(cè)定、肽圖及修飾、 二硫鍵、寡糖及糖肽分析、宿主細(xì)胞殘留蛋 白鑒定與定量等眾多分析項(xiàng)目都是Q-Orbitrap 型質(zhì)譜的分析強(qiáng)項(xiàng)。由于一臺(tái)Q-Orbitrap具備全面且強(qiáng)大的分析性能，使其性價(jià)比遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu) 于傳統(tǒng)的使用Q-TOF與三重四級(jí)桿兩臺(tái)質(zhì)譜來(lái)完成從 蛋白表征到定量工作的組合[6,10-15] 。

目前單抗類(lèi)藥物的給藥量一般為 1- 10mg/kg，在血中的濃度從ug/mL到sub-ng/mL， 因此其期望定量限可到 sub-ng/mL 水 平 。 Mireia等采用附著生物素及抗抗體磁珠的免疫 富集技術(shù)，使用微升液相與TSQ Vantage Triple Quadrupole 質(zhì)譜聯(lián)用 ， 實(shí)現(xiàn)了血清中 7.03 ng/mL到450 ng/mL的單抗的定量[7] . Duan等使 用納升液相與TSQ Quantum Triple Quadrupole 質(zhì)譜聯(lián)用，在血漿中實(shí)現(xiàn)了12.9 ng/mL至32.3 µg/mL的單抗定量范圍[9] ，在不同組織中達(dá)到 了0.156 至 0.312 μg/g的單抗定量限[8] 。Paul等 在血漿中使用Q-Exactive Quadrupole Orbitrap 質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了Cetuximab單抗在血漿中 從6.60 到 660 pmol/mL (19.8 to 1980 fmol on column)的 定量[11] 。Gu等使用PRM法測(cè)定大鼠血漿中人 重組干擾素含量的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)現(xiàn)了sub-ng/mL 定量，定量范圍達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)（圖4）[15] 。 簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，使用Q-Orbitrap進(jìn)行蛋白代謝 分析具有如下優(yōu)點(diǎn)： • 高靈敏度 • 寬線性范圍 • 抗基質(zhì)噪音能力強(qiáng) • 同時(shí)定性定量 • 方法設(shè)置簡(jiǎn)單 • 無(wú)需方法優(yōu)化

質(zhì)譜技術(shù)可有效地解決ELISA方法做蛋白 藥物代謝分析時(shí)遇到的自身抗體干擾、定量 范圍窄、非特異性結(jié)合、交叉反應(yīng)、以及免 疫原性影響等問(wèn)題。而且，隨著質(zhì)譜技術(shù)的

不斷發(fā)展，特別是以O(shè)rbitrap為代表的，性能 高，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單的質(zhì)譜的推廣應(yīng)用， 以及更高靈敏度的三重四極桿質(zhì)譜的推出，加之納升液相與免疫富集等方法的輔助，蛋 白藥物代謝分析即將進(jìn)入全新的技術(shù)時(shí)代。

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