非變性質譜即天然質譜法（Native Mass Spectrometry），是一種用于分析蛋白結 構的質譜方法。使用這種方法，不改變蛋白 結構，因此可獲得分析物在天然狀態(tài)下 的結構信息[1] ，這是Native MS的在蛋白藥物分 析中的個重要特性：非變性分析特性。 之所以可以保持蛋白的天然結構，一方面是 因為在Native MS分析中，避免了乙腈等有機 溶劑的使用，而是采用乙酸銨中性緩沖溶液； 另一方面，在離子化時，為了避免了高溫及 高電壓條件，而采用了如納升靜態(tài)噴霧等柔 和的離子化方式[2] 。

相對于常見的變性質譜法，在Native MS 的原始質譜數據中，蛋白的離子信號移動到 了更高的質荷比區(qū)域。這是由于在常見的全 蛋白分子量測定中（變性質譜法），蛋白在 含有乙腈的緩沖液及高溫高電壓的離子化條 件下，其結構被破壞，而伸展開來，暴 露出了更多的可結合H+的部分，因此攜帶了更 多的電荷。對于單抗來說，采用變性質譜法，其質荷比主要分布于2000m/z至4000m/z，而 Native MS 條件下 ， 則分布于 5000m/z 至 7000m/z區(qū)域（圖1）。從圖一可以看出，在 Native MS圖譜中，不但信號的分布區(qū)域位于 高質荷比區(qū)，更重要的是，由于所帶電荷數 減少，信號分布變得疏離。在復雜樣本分析 時，疏離的信號分布會降低信號相互覆蓋的 可能性。這是Native MS在蛋白藥物分析中的 第二個重要特性：簡化圖譜特性。

在單抗藥物相關分析中，Native MS的非 變性分析特性，被用于Cystine Linked ADC（利 用還原二硫鍵形成的抗體-藥物偶聯(lián)物）以及 抗體-抗原結合等分析；而Native MS的簡化圖 譜特性則被可用于糖基化定量、雙功能抗體、 混合抗體等分析項目中。

由于Native MS中樣品的質荷比遠遠高于 常見的質譜信號，因此要對質譜硬件進行特 殊設計。問世的Exative Plus EMRTM質譜， 是以超高分辨質量分析器Orbitrap(靜電場軌道阱)為基礎的，專為Native MS分析需求所設計 的一款儀器 ， 其質荷比范圍可覆蓋至 20000m/z。Exative Plus EMR以其超高分辨率、 信號基線分辨能力以及*的穩(wěn)定性，不但 被廣泛應用在蛋白藥物分析，甚至在分子量 高達80萬Da的蛋白復合體分析中都已被采用[3] （圖2）。

除高質荷比范圍采集能力外，去除粘附在 蛋白上的溶液分子及金屬離子也是提高Native MS圖譜質量的必要條件。粘附分子或離子的 存在會造成蛋白質量變大的假象 [4] （圖3）， 從而影響分析準確度。Exative Plus EMR在離子 源以及HCD碰撞池，為去除粘附分子及離子做 了*的專門化設計[3] 。不同于其他的高分辨 質譜，Exactive Plus EMR允許用戶設置一定的 HCD碎裂能量以去除粘附分子及離子；同時， *的EMR mode具有Automatically HCD GasControl 功能，可對HCD碰撞池中的N2氣壓進 行調節(jié)。在Exactive Plus EMR上通過協(xié)同優(yōu)化 源內裂解能量 、 HCD 碎裂能量和 HCD gas control三個參數，可盡可能多地除去粘附分子 及離子。

隨著單抗藥物市場競爭及應對抗體抗藥性 的需求，單抗-藥物偶聯(lián)物（Antibody Drug Conjugate，ADC）類藥物已經成為新型抗體藥 物開發(fā)的一個重要方向。在各種ADC藥物中， 通過還原單抗二硫鍵，將小分子藥物連接到 半胱氨酸巰上而形成的Cystine Linked ADC藥物， 由于其較好的結構均一性及更穩(wěn)定的化學連 接形式，已經成為ADC藥物開發(fā)的重要方向。 但是，由于負責連接輕、重鏈的二硫鍵被打 開，單抗內各鏈間依靠非共價結合，因此， 此類ADC藥物的結構穩(wěn)定性差。如果采用 常規(guī)的質譜方法分析其DAR值（Drug Antibody Ratio），各鏈會發(fā)生分離，導致分析失敗。 而Native MS的非變性分析特性，正適用于此。 圖4為Cystine Linked ADC藥物Adcetris進行DAR 分析的原始質譜數據（Adcetris是FDA于2011 年批準的用于治療霍奇金淋巴瘤以及復發(fā)性 間變性大細胞淋巴瘤ADC藥物）[4] 。圖中分別 展示了去糖基化與保留糖基化非變性質譜數 據，可以看到，即使是在樣品復雜程度巨大的含糖鏈ADC藥物的圖譜，含相同小分子藥結 合數量的單抗信號也都被清晰分辨，這就為 DAR值的準確計算打下了堅實的基礎。

Native MS在單抗寡糖的含量測定分析中 具有*的角度與優(yōu)點（圖5）。在常見的分 析方法中，首先是將糖鏈通過糖苷酶將寡糖 從蛋白中釋放出來。被釋放的寡糖將通過多 步處理，使其連接熒光基團。熒光基團的加 入是因為寡糖本身無光譜吸收，且離子化效 率非常低，不利于質譜分析。標記熒光基團 后，可使用熒光檢測器分析，并提高其質譜 分析的離子化效率。但是熒光標記必須經過 多步復雜的樣品處理操作，整個實驗時間也 需要約2天時間。因此此種方法具有工作效率低，實驗成本高，操作難度大等缺點。如果 操作經驗不足，易造成重現性差等問題。特 別是對于含有唾液酸的寡糖，在樣品處理時 容易丟失，造成實驗分析失敗。此外，在連 接了熒光基團的寡糖中，熒光基團只占了非 常小的一部分，對其寡糖離子化效率的提升 有限。這也是寡糖在進行液質分析時，采用 液相-熒光檢測-質譜檢測的原因（熒光信號主 要負責定量，質譜信號主要負責定性）。既 然熒光標記法具有如此多的不足之處，為何 其在單抗的寡糖分析中仍被廣泛應用？歸根 結底，無非是因為想克服寡糖檢測信號的問 題。而單抗上的寡糖其實天然地攜帶了一個 可提升信號的標記基團——抗體肽鏈部分?？?體分子量近15萬Da，而糖鏈分子量僅為3-4千

Da左右。因此在質譜分析的離子化過程中， 單抗的肽鏈將起到決定性作用。Rosati等的研 究，有力的證明了這一點：唾液酸含量是寡 糖離子化大的影響因素，唾液酸越多，寡 糖離子化越差，因此會造成不同組成糖鏈的 離子化效率不同，從而造成巨大的寡糖定量 分析誤差。Rosati等發(fā)現，對于單抗，采用 Native MS分析，在去除唾液酸前后，其定量 結果相同[4] 。這就證明，在Native MS條件下， 唾液酸對單抗離子化效率沒有影響， 可以得 到更為準確的定量結果。除避免了由于離子 化效率的影響， Native MS不需要復雜的實驗 操作，從而巨大地提高了實驗的重現性和準 確度。此外，整個實驗時間也大幅縮短，大 大提高了工作效率。在應用Native MS對單抗 寡糖準確定量的背后，包含了Native MS的簡化圖譜特點：Native MS疏離的信號分布會降 低不同糖型信號間相互覆蓋的可能性，高質 量的原始質譜數，是寡糖準確定性與定量的 保證。類似的應用還有難度更大的混合抗體 分析等[5] 。在Natalie等人的工作中，采用以 Orbitrap為基礎的Native MS分析15個單抗混合 物，并對其進行定量分析，大定量分析誤 差（標準差）僅為1.14%[5]

借用生物質譜人Heck在2012年Nature Methods上的一段話作為結尾“我們相信，以 Orbitrap質譜分析器為基礎的非變性質譜法， 將會對結構生物學、生物化學、系統(tǒng)生物學、 蛋白相互作用網絡研究，特別是生物藥物表 征分析等多個領域產生巨大的影響”[3] 。

更多產品請點擊：Orbitrap(靜電場軌道阱)