生物制藥微課堂|第三期-單克隆抗體藥物的電荷變異體表征

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生物制藥微課堂

單克隆抗體是復(fù)雜的糖蛋白，通常呈現(xiàn)微觀不均一性，包括各種修飾形成的變異體。這些變異體可能來(lái)自復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)工藝、純化及制劑等制造過(guò)程或儲(chǔ)存過(guò)程的任何階段。由于抗體所帶電荷差異造成的異質(zhì)性稱為電荷變異體，這些變異體可能會(huì)影響抗體的穩(wěn)定性，藥效，免疫原性等，因此對(duì)電荷變異體的表征和質(zhì)控至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)變異體的分子量及肽圖的表征，可以確定其修飾種類及后續(xù)QC中的質(zhì)量監(jiān)控。

本期微課堂為您帶來(lái)：

單克隆抗體藥物電荷變異體分析解決方案

賽默飛提供兩種方案，讓您的分析選擇更靈活，輕松應(yīng)對(duì)！

方案1：在線CEX-MS方案

本期微課堂來(lái)自NIBRT的Jonathan Bones報(bào)告，介紹了如何使用在線CEX-MS的分析方法快速在完整蛋白水平上表征變異體修飾。
 

Advances in Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using pH Gradient Cation Exchange Chromatography hyphenated to Mass Spectrometry

要點(diǎn)1：

電荷變異體分析常用的PH梯度或鹽梯度方法，其流動(dòng)相一般含不揮發(fā)性鹽，需要色譜分離后再接餾分，除鹽凍干再進(jìn)質(zhì)譜分析，這一復(fù)雜過(guò)程容易造成樣品損失及蛋白變性。因此在線CEX-MS的分析方法能夠很好的解決這一問(wèn)題，通過(guò)使用低離子強(qiáng)度、揮發(fā)性鹽的流動(dòng)體系，在PH梯度條件下分離電荷變異體，同時(shí)進(jìn)質(zhì)譜分析，能夠快速在完整蛋白水平上表征變異體修飾，包括C端賴氨酸變異體、脫酰胺、焦谷氨酸環(huán)化、糖化以及抗體相關(guān)片段等。

CVA-MS on Q Exactive Plus MS

要點(diǎn)2：

對(duì)于在線CEX-MS分析，怎樣在保證完美的色譜分離度情況下，準(zhǔn)確檢測(cè)每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的修飾種類？此次報(bào)告會(huì)詳細(xì)介紹流動(dòng)相的選擇、PH條件優(yōu)化及阿達(dá)木單抗、西妥昔單抗的具體案例分析，以及如何根據(jù)所得數(shù)據(jù)分析電荷變異體的來(lái)源，例如由于宿主細(xì)胞殘留蛋白的存在而造成單抗降解為不同的片段等。

CEX-MS analysis of Adalimumab

要點(diǎn)3：

Zipchip-MS微流控毛細(xì)管電泳質(zhì)譜作為CEX-MS的互補(bǔ)技術(shù)，在電荷變異體分析中有很好的性能，可在更短的分析時(shí)間，使用少量樣品，得到完整的電荷變異體數(shù)據(jù)。對(duì)于酸性蛋白質(zhì)，可使用AEX-MS分析，能夠在低PH梯度下觀測(cè)到更多蛋白異構(gòu)體，如唾液酸化、巖藻糖基化修飾及降解片段等。該部分內(nèi)容作為CEX-MS的互補(bǔ)技術(shù)，會(huì)以實(shí)際案例來(lái)說(shuō)明如何從全方面表征抗體電荷變異體。

AEX-MS analysis of Ovalbumin

方案2：離線CEX-MS分析方案：

賽默飛離線CEX-MS方案，包括超高效液相Vanquish，餾分收集器，及超高分辨質(zhì)譜Orbitrap，可以從完整蛋白、亞基及肽圖三個(gè)層面對(duì)離子交換酸堿峰進(jìn)行深度表征分析。相比在線CEX-MS方案，該方法可以使用非揮發(fā)性鹽，使CEX的方法優(yōu)化更簡(jiǎn)便，但需要增加凍干除鹽等步驟，可根據(jù)不同需求選擇合適方案。

完整分子量分析：

如下圖1所示，收集CEX分離所得餾分，經(jīng)過(guò)除鹽凍干處理，LC-MS檢測(cè)，可在完整分子量層面觀測(cè)到各個(gè)餾分的糖型分布情況，大部分糖基化修飾形成酸性峰，C端賴氨酸丟失及酰胺化等修飾形成堿性峰^[1]。

圖1：CEX餾分完整分子量分析

輕重鏈分析：

輕重鏈分析可進(jìn)一步在分子量層面觀測(cè)到更多的信息，如加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，不同的溫度及PH條件下，蛋白藥物會(huì)發(fā)生氧化及降解等反應(yīng)。將CEX分離的餾分經(jīng)過(guò)DTT還原等處理，通過(guò)orbitrap檢測(cè)，在超高分辨的性能下可測(cè)得輕鏈單同位素分子量，并觀測(cè)到微小變化的修飾峰，下圖所示為CEX的某個(gè)餾分經(jīng)DTT還原后的質(zhì)譜分析結(jié)果，測(cè)得輕重鏈及氧化、脫水、糖化等雜質(zhì)峰^[2]。

肽圖分析：

肽圖分析能夠精確定位翻譯后修飾位點(diǎn)及發(fā)現(xiàn)更低豐度的修飾，如下圖所示，通過(guò)對(duì)三個(gè)酸性峰AF1-AF3及堿性峰BF1、BF2餾分進(jìn)行肽圖分析，可確定每個(gè)餾分包含的修飾種類及相對(duì)含量，相對(duì)含量?jī)H為0.01%的修飾也能被準(zhǔn)確鑒定，其中紅色標(biāo)注為主要修飾。Orbitrap的超高靈敏度和分辨率能夠檢測(cè)到更多含量的PTMs及序列變異體，尤其對(duì)于餾分收集樣品，更需要高靈敏度檢測(cè)方法。

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單克隆抗體藥物電荷變異體分析相關(guān)解決方案

參考文獻(xiàn)：

1. François G, Blandine D, et al. Unbiased in-depth characterization of CEX fractions from a stressed monoclonal antibody by mass spectrometry. mAbs, 2017. 

2. Deyun W, Colin W, et al. Characterization of Drug Product-related Impurities and Variants of a Therapeutic Monoclonal Antibody by Higher-energy C-trap Dissociation Mass Spectrometry. Anal. Chem.,2014.

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