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單細(xì)胞組學(xué)

單細(xì)胞組學(xué)研究在揭示細(xì)胞群體異質(zhì)性、發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)特性以及識(shí)別所關(guān)注的少數(shù)亞群等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注[1]。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者，由于氨基酸組成的不同、可變剪切以及翻譯后修飾狀態(tài)的不同給蛋白質(zhì)帶來(lái)了豐富的多樣性，在蛋白質(zhì)層面對(duì)生理活動(dòng)的多樣性和復(fù)雜性的揭示，逐漸成為探索生命活動(dòng)進(jìn)程的焦點(diǎn)[2]。近年來(lái)，隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序等技術(shù)的突破，在單細(xì)胞層面深入研究基因組和轉(zhuǎn)錄組成為現(xiàn)實(shí)。高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)不僅揭示了細(xì)胞之間的異質(zhì)性，還保留了傳統(tǒng)群體研究中所發(fā)現(xiàn)的共性問(wèn)題，這有助于我們更加全面地理解細(xì)胞的功能和調(diào)控機(jī)制[1]。但由于遺傳物質(zhì)與蛋白表達(dá)含量之間并不是一一對(duì)應(yīng)的定量關(guān)系，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以提供基因表達(dá)的信息，但無(wú)法直接推斷出蛋白質(zhì)含量的變化。此外，由于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)空上的差異性，以及翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì)調(diào)控等因素，使得對(duì)單細(xì)胞開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為一個(gè)必要且迫切的需求。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)能夠提供每個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾的定量信息，為解析生命活動(dòng)在單細(xì)胞層面上的奧秘提供了新途徑和新見(jiàn)解[3]。

由于單細(xì)胞中所表達(dá)的蛋白含量極低且不同的細(xì)胞之間蛋白表達(dá)量也差異極大，如下圖A所示，單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量整體在pg-ng級(jí)別，一個(gè)精子中蛋白的總量在18pg左右，一個(gè)HeLa細(xì)胞則含有約250 pg蛋白質(zhì)，且不同于遺傳物質(zhì)可以擴(kuò)增，蛋白質(zhì)本身無(wú)法進(jìn)行數(shù)量的擴(kuò)增放大，因此樣品前處理?yè)p失和檢測(cè)儀器的靈敏度極大地限制了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展[3]。近年來(lái)，隨著樣品前處理技術(shù)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器性能的不斷進(jìn)步，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究經(jīng)歷了深度與廣度的巨大變化[3]。2018年Rayn T. Kelly團(tuán)隊(duì)基于nanoPOTS玻璃芯片這一蛋白質(zhì)前處理技術(shù)通過(guò)減小反應(yīng)體積而減少樣本損耗，在單細(xì)胞中鑒定到了超過(guò)600個(gè)蛋白質(zhì)[4]。2020年Zhu Ying團(tuán)隊(duì)則進(jìn)一步利用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的分選，利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMTs）結(jié)合ThermoFisher的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀在nanoPOTS蛋白前處理技術(shù)下成功從單細(xì)胞中鑒定到了超過(guò)1716個(gè)蛋白[5]。2023年，Karl Mechtler團(tuán)隊(duì)則利用CellenONE平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞分選，并使用proteoCHIP芯片進(jìn)行蛋白質(zhì)前處理，在Orbitrap Exploris 480-FAIMS質(zhì)譜儀系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞1940個(gè)蛋白的鑒定[6]。時(shí)間進(jìn)入到2024年，浙江大學(xué)方群團(tuán)隊(duì)則利用微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)PiSPA單細(xì)胞分選技術(shù)，結(jié)合高靈敏度質(zhì)譜分析，在單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中檢測(cè)到最多3 000個(gè)蛋白質(zhì)[7]。同年，Jesper V. Olsen團(tuán)隊(duì)利用其開(kāi)發(fā)的Chip-Tip方法單細(xì)胞蛋白前處理策略集合ThermoFisher的全新一代Orbitrap Astral質(zhì)譜儀系統(tǒng)將單細(xì)胞蛋白組鑒定深度帶入一個(gè)全新的境界。利用Chip-Tip 方法，結(jié)合CellenONE高通量的從細(xì)胞懸液中分選單細(xì)胞，并在proteoCHIP-EVO96中進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)處理，結(jié)合Orbitrap Astral的窄窗口 DIA（nDIA）方法能夠穩(wěn)定的在單HeLa細(xì)胞水平鑒定到超過(guò)5 000種蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平全面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[8]。

圖1  單細(xì)胞蛋白質(zhì)含量與蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量的圖示

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綜上所述，隨著單細(xì)胞樣品前處理技術(shù)以及高端質(zhì)譜檢測(cè)器性能的突飛猛進(jìn)，目前單細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢測(cè)在技術(shù)層面的難題已近于克服，當(dāng)前單細(xì)胞層面蛋白質(zhì)檢出數(shù)量已達(dá)到一個(gè)全新高度，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在技術(shù)上的進(jìn)步已使得我們能夠以與此前完全不同的視角去研究原有的生物學(xué)問(wèn)題，并與單細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組及代謝組等研究方法互為補(bǔ)充，極大地拓展了我們探索生命奧秘的技術(shù)手段。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢測(cè)在技術(shù)上的突破也使得在單細(xì)胞層面開(kāi)展蛋白質(zhì)翻譯后修飾鑒定成為一種可能，然而，盡管技術(shù)進(jìn)步迅速，但由于翻譯后修飾的豐度極低、現(xiàn)有的富集策略與前處理方案存在不兼容且缺乏靈敏的檢測(cè)方案等因素的存在，在單細(xì)胞水平上對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模分析仍然極具挑戰(zhàn)性。目前針對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行修飾組學(xué)鑒定的報(bào)道還較少，為此，本文將針對(duì)兩篇單細(xì)胞修飾鑒定佳作展開(kāi)介紹，以期為各位讀者開(kāi)展相關(guān)研究工作提供思路。

文章一

第一篇文章來(lái)自于丹麥哥本哈根大學(xué)Jesper V. Olsen團(tuán)隊(duì)的葉子璐博士，目前葉子璐博士已任中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所研究員[8]。如前所述，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備工作流程的關(guān)鍵考慮因素包括盡可能保持樣品濃縮以減少表面吸附損失，減少緩沖液蒸發(fā)和移液步驟以提高重現(xiàn)性并最大化檢測(cè)靈敏度[8]。有基于此，作者開(kāi)發(fā)了一種近乎無(wú)損的基于 LFQ單細(xì)胞蛋白質(zhì)組工作流程，作者專為單細(xì)胞樣品制備設(shè)計(jì)了名為proteoCHIP EVO 96的芯片，能夠以納升水平的最小體積運(yùn)行，可同時(shí)并行制備多達(dá) 96 個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)樣品，該芯片專門(mén)針對(duì)與 Evosep One LC 系統(tǒng)的兼容性進(jìn)行了定制，實(shí)現(xiàn)了無(wú)需額外移液步驟的簡(jiǎn)化樣品轉(zhuǎn)移過(guò)程。利用CellenONE高通量單細(xì)胞分選設(shè)備及proteoCHIP EVO 96前處理技術(shù)，結(jié)合Orbitrap Astral的窄窗口DIA（nDIA）方法, 顯著提高了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的靈敏度和效率（圖 2A）。

作者通過(guò)比較分析確定了最佳的 nDIA 方法，發(fā)現(xiàn)使用 4Th DIA 窗口以及6ms 最大離子注入時(shí)間（4Th6ms）可獲得最高的蛋白質(zhì)組覆蓋度，并實(shí)現(xiàn)在單個(gè) HeLa 細(xì)胞中中位數(shù)為 5204 種蛋白質(zhì)的鑒定水平，并在其中一次 HeLa 細(xì)胞制備中鑒定出超過(guò) 6000 種蛋白質(zhì)（圖 2B）。當(dāng)進(jìn)一步擴(kuò)大細(xì)胞的數(shù)量，能夠從僅 20個(gè)細(xì)胞的樣品總鑒定出超過(guò) 7000 種蛋白質(zhì)。在肽段水平上實(shí)現(xiàn)的深度鑒定則更為顯著，單細(xì)胞樣品的肽段中位鑒定數(shù)為 41700，20個(gè)細(xì)胞樣品的肽段中位鑒定數(shù)為 98054（圖 2C），單細(xì)胞的蛋白質(zhì)序列中位覆蓋度為 12.9%，20個(gè)細(xì)胞樣品的為 25%（圖 2D）。這種高深度的肽段覆蓋也促進(jìn)了高度準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量，基于iBAQ值的強(qiáng)度絕對(duì)定量顯示出跨越約五個(gè)數(shù)量級(jí)的廣泛動(dòng)態(tài)范圍，相對(duì)蛋白質(zhì)豐度估計(jì)也表明，不同細(xì)胞數(shù)量樣品的 iBAQ 值幾乎呈線性關(guān)系（圖 2E）。作者也開(kāi)展了不同亞細(xì)胞定位蛋白的鑒定統(tǒng)計(jì)，其中穩(wěn)定鑒定出超過(guò) 200 種質(zhì)膜蛋白，也進(jìn)一步說(shuō)明了該方法的穩(wěn)健性（圖 2F）。

圖2 高通量無(wú)標(biāo)記單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的工作流程及結(jié)果

(A) 單細(xì)胞分離和蛋白質(zhì)組學(xué)處理工作流程的示意圖。(B) 使用不同的 nDIA 設(shè)置在單個(gè)、10 個(gè)、20 個(gè)和 40 個(gè) HeLa 細(xì)胞中鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量。(C) 使用不同的 nDIA 設(shè)置在單個(gè)、10 個(gè)、20 個(gè)和 40 個(gè) HeLa 細(xì)胞中鑒定的肽段數(shù)量。(D) 單細(xì)胞、10 細(xì)胞和 20 細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)序列覆蓋百分比。(E) 顯示不同細(xì)胞數(shù)量下定量范圍和一致性的 iBAQ 值分布。(F) 細(xì)胞區(qū)室中蛋白質(zhì)定位的概述。搜索使用了 Spectronaut（v18）（點(diǎn)擊查看大圖）

鑒于作者開(kāi)發(fā)的近乎無(wú)損的基于 LFQ單細(xì)胞蛋白質(zhì)組工作流程在肽段前體水平所實(shí)現(xiàn)的高深度覆蓋鑒定，這不僅增強(qiáng)了蛋白質(zhì)鑒定和定量，還可能揭示大量與翻譯后修飾相關(guān)的信息。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組樣品中深入研究了兩種具有極高細(xì)胞重要性的翻譯后修飾-磷酸化和糖基化，蛋白質(zhì)磷酸化作為一種非常重要的翻譯后修飾，在細(xì)胞凋亡、炎癥、代謝、增殖、蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能[9]，磷酸化信號(hào)級(jí)聯(lián)是生物體信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子機(jī)制，因此開(kāi)展磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究一直是生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)之一。N-糖基化是蛋白質(zhì)一種普遍且重要的翻譯后修飾，它介導(dǎo)了包括細(xì)胞間識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)以及疾病發(fā)生和發(fā)展等多種關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程。在許多惡性腫瘤和其他疾病中都發(fā)現(xiàn)了 N-糖基化譜的改變，因此全面表征蛋白質(zhì) N-糖基化對(duì)于增進(jìn)我們對(duì)健康和疾病的理解至關(guān)重要[10]。為此，作者對(duì)該兩種翻譯后修飾開(kāi)展不進(jìn)行任何特定富集的單細(xì)胞位點(diǎn)鑒定。

作者專注實(shí)現(xiàn)催化磷酸化反應(yīng)的激酶的發(fā)現(xiàn)，基于開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)方案在不進(jìn)行任何修飾富集的情況下，在單細(xì)胞內(nèi)定量了 168 種蛋白激酶，涵蓋了所有主要的激酶家族（圖 3A）。值得注意的是，來(lái)自 CMGC 組的 CDK1 和來(lái)自 STE 組的 MAPK1 等激酶表現(xiàn)出最高的豐度，而酪氨酸激酶則較少。隨后，作者在單細(xì)胞樣品中以絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸磷酸化為可變修飾進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，并使用 20 個(gè)細(xì)胞樣品作為載體蛋白質(zhì)組（carrier proteome）。盡管沒(méi)有進(jìn)行任何特定的細(xì)胞刺激或樣品處理來(lái)保留磷酸化位點(diǎn)，但該搜索方法依然在單細(xì)胞中可靠地鑒定出120個(gè)絲氨酸、28個(gè)蘇氨酸和 13個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖 3B）。motif分析顯示出常見(jiàn)的磷酸化基序，這與我們的激酶組數(shù)據(jù)高度一致（圖 3C）。重要的是，對(duì)酪氨酸磷酸化在 m/z 216.042 處的選擇性亞銨離子的 DIA-MS/MS 光譜的提取離子色譜圖（XIC）篩選顯示，在整個(gè) LC 洗脫曲線中存在強(qiáng)烈信號(hào)（圖 3D）。作者還研究了蛋白質(zhì)糖基化模式，并在所有糖基化途徑中檢測(cè)到多種糖基轉(zhuǎn)移酶（圖 3E）。采用類(lèi)似于磷酸酪氨酸亞銨離子篩選的策略，作者對(duì)常見(jiàn)聚糖進(jìn)行了氧鎓離子篩選，包括單糖 HexNAc（圖 3F）和 NeuAc（圖 3G）以及二糖 Hex-HexNAc（圖 3H）。所有聚糖都大量存在，并且在大多數(shù) MS2 光譜中都能檢測(cè)到，即使使用 nDIA 也是如此。亞銨離子和氧鎓離子的篩選表明，蛋白翻譯后修飾（如磷酸化和糖基化）在單細(xì)胞中普遍存在。

作者的研究證明了在無(wú)需特定富集方案的前提下進(jìn)行翻譯后修飾分析的可行性。這一進(jìn)展為更簡(jiǎn)化、高效地探索翻譯后修飾位點(diǎn)乃至開(kāi)展組學(xué)鑒定鋪平了道路，揭示了細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的多方面調(diào)控機(jī)制。然而，由于當(dāng)前數(shù)據(jù)庫(kù)搜索算法的限制，修飾肽段的精確鑒定仍然具有挑戰(zhàn)性。

圖3 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的翻譯后修飾分析

(A) 激酶組樹(shù)狀圖，展示了單細(xì)胞中主要激酶家族的 168 種激酶的定量情況，節(jié)點(diǎn)顏色和大小表示 iBAQ 豐度。(B) 柱狀圖，描繪了單細(xì)胞和 20 細(xì)胞樣品中鑒定的絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）和酪氨酸（Y）殘基的磷酸化位點(diǎn)數(shù)量。(C) 序列標(biāo)志分析，說(shuō)明了在單細(xì)胞樣品中鑒定的最常見(jiàn)的磷酸化基序。(D) 磷酸酪氨酸（m/z 216.0426）的亞銨離子在液相色譜洗脫曲線中的提取離子色譜圖（XIC）。(E) 單細(xì)胞中鑒定的糖基因的可視化。(F) HexNAc（m/z 204.087）的氧鎓離子的 XIC，表明聚糖在 MS2 光譜中的存在。(G) NeuAc（m/z 274.092）的氧鎓離子的 XIC，反映了聚糖在 MS2 光譜中的豐度。(H) 二糖 Hex-HexNAc（m/z 366.139）的氧鎓離子的 XIC，反映了聚糖在 MS2 光譜中的豐度（點(diǎn)擊查看大圖）

文章二

在自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，常用的定量策略包括非標(biāo)記定量（lable free quantification，LFQ）和同位素標(biāo)記定量（isotope labeling quantification）。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中的早期經(jīng)典方法之一是基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMTs）的同位素標(biāo)記定量解決方案SCoPE-MS。Slavov 團(tuán)隊(duì)在 2018 年開(kāi)發(fā)了基于 TMT 標(biāo)記的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析方法，利用了 TMT 載體（TMT-carrier）的概念 。在該策略中，通過(guò)將單細(xì)胞通道和使用大量細(xì)胞的 TMT 載體通道（TMT-carrier channel）的信號(hào)相結(jié)合，大幅提高了肽段的 MS1 強(qiáng)度，從而觸發(fā)了顯著改進(jìn)的 MS/MS 裂解[11]。實(shí)現(xiàn)了肽段鑒定效率的大幅提高，這有助于以更高的靈敏度和通量進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析。

鑒于N-糖基化在諸多惡性腫瘤和其他疾病進(jìn)展中的重要性，在單細(xì)胞分辨率下闡明 N-糖基化模式的變化，將極大地促進(jìn)對(duì)其在腫瘤微環(huán)境和免疫治療中關(guān)鍵作用的理解。考慮到單細(xì)胞/微量細(xì)胞中樣本量極少且與富集方法不兼容，國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）的秦偉捷研究員課題組開(kāi)發(fā)了一種基于 TMT 標(biāo)記的完整N-糖肽分析非富集策略（圖4）。該策略并非依賴于單個(gè)單細(xì)胞/微量細(xì)胞樣品中完N-糖肽響應(yīng)較差的 MS信號(hào)強(qiáng)度，而是將使用從大量細(xì)胞樣品中獲得的N-糖肽的TMT 載體通道與TMT研究通道中的單細(xì)胞/微量細(xì)胞混合，且不進(jìn)行富集，以獲得組合的 MS1 信號(hào)。通過(guò)這種方式，研究通道可以避免富集步驟中的樣品損失，從而支持在極少量樣品中進(jìn)行超靈敏的 N-糖肽鑒定。即使在單細(xì)胞/微量細(xì)胞中非糖肽的干擾下，N-糖肽顯著提高的 MS1 信號(hào)也能有效地觸發(fā) MS/MS 裂解，從而促進(jìn)了對(duì)單個(gè)以及50 個(gè) HeLa 細(xì)胞的首次大規(guī)模定量完整N-糖蛋白組分析。由于單細(xì)胞 / 微量細(xì)胞樣品未進(jìn)行富集步驟，該策略不受不同糖型和豐度的 N - 糖肽之間富集效率差異的影響，因此可能導(dǎo)致更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

圖4 基于 TMT 標(biāo)記的用于單細(xì)胞/微量細(xì)胞大規(guī)模N-糖肽鑒定的載體策略（點(diǎn)擊查看大圖）

為了驗(yàn)證這一概念和策略，作者制備了三個(gè)樣品以測(cè)試載體策略在不進(jìn)行富集的情況下從低ng水平樣品中進(jìn)行深度N-糖肽鑒定的可行性（圖 5A）。如圖 5B 所示，對(duì)于樣品 I使用 TMT10 的每個(gè)通道（不包括 126、127C 和 128C）標(biāo)記 50ng HeLa 細(xì)胞裂解消化物，并最終將七個(gè)通道合并進(jìn)行質(zhì)譜分析。對(duì)于樣品 II，使用 TMT126（載體通道）標(biāo)記從 40μg HeLa 細(xì)胞裂解消化物中富集的N-糖肽，其余通道留空。樣品III是樣品I和II的組合，以評(píng)估在不進(jìn)行富集的情況下使用載體通道促進(jìn)研究通道中痕量樣品的 N-糖肽鑒定的可行性。對(duì)于沒(méi)有載體通道的樣品 I，由于在未富集樣品中其豐度極低，僅鑒定出 112個(gè) N-糖肽。然而，在樣品 III中，通過(guò)在通道 TMT126 中添加載體N-糖肽，完整N-糖肽的數(shù)量至少增加了14倍。同樣，樣品 III 中 N-糖肽的總MS 強(qiáng)度也顯著增強(qiáng)（圖 5C），這表明應(yīng)用糖載體大大增加了在痕量樣品中鑒定和定量未富集的 N-糖肽的機(jī)會(huì)。

圖5 糖載體策略的可行性評(píng)估

(A) I、II 和 III 實(shí)驗(yàn)中的 TMT 通道分配。(B) 三個(gè)樣品中每個(gè)樣品的定量 N - 糖肽數(shù)量。(C) N - 糖肽的總強(qiáng)度。

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由于糖肽豐度低、受非糖肽的抑制以及在富集過(guò)程中不可避免的樣品損失，使用直接質(zhì)譜分析或傳統(tǒng)的親水相互作用液相色譜（HILIC）富集方法，從單個(gè)和 50個(gè)HeLa 細(xì)胞中作者均未鑒定出 N-糖肽。然而，使用糖載體策略從單個(gè)和 50個(gè)HeLa 細(xì)胞中分別獲得了超過(guò) 260個(gè)和 500個(gè)N-糖肽，這表明該策略對(duì)單細(xì)胞 / 微量細(xì)胞研究具有高靈敏度（圖 6A）。如圖 6B 所示，在跨越四個(gè)數(shù)量級(jí)強(qiáng)度范圍的累積曲線中，從七個(gè)單個(gè)HeLa細(xì)胞中共獲得了608個(gè)完整的N-糖肽。對(duì)于定量分析，當(dāng)樣品量從 50 ng 減少到單個(gè)細(xì)胞時(shí)，鑒定出的 N-糖肽的強(qiáng)度分布呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)（圖 6C）。相比之下，由于基于數(shù)據(jù)依賴采集的質(zhì)譜分析的隨機(jī)性，變異系數(shù)（CV）隨著樣品量的減少而增加，并且通常預(yù)計(jì)較低的樣品量會(huì)有更高的定量波動(dòng)。然而，少量細(xì)胞（10 個(gè)和50個(gè)細(xì)胞）的CV僅略高于50 ng樣品中的CV，這表明糖載體策略具有高重現(xiàn)性。對(duì)于單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)較高的CV,這可能部分歸因于單個(gè)細(xì)胞之間的異質(zhì)性（圖 6D）。此外，作者還將糖載體策略應(yīng)用于50個(gè)細(xì)胞水平的三種細(xì)胞系（HeLa、AC16 和 A549）的差異 N-糖蛋白組分析。如圖 6E 所示，對(duì)定量的完整N-糖肽進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果表明細(xì)胞按細(xì)胞類(lèi)型分組，三種細(xì)胞系之間存在明顯差異，這進(jìn)一步證明了糖載體策略的定量重現(xiàn)性。重復(fù)之間的技術(shù)差異低于細(xì)胞類(lèi)型之間的 N - 糖蛋白組模式差異，這表明該策略能夠識(shí)別細(xì)胞異質(zhì)性。進(jìn)一步將樣品量減少到單細(xì)胞水平揭示了不同 HeLa 細(xì)胞之間的細(xì)胞異質(zhì)性。在無(wú)監(jiān)督層次聚類(lèi)分析中發(fā)現(xiàn)了單個(gè) HeLa 細(xì)胞中 N - 糖肽的差異表達(dá)（圖 6F）。作為概念驗(yàn)證，該策略成功區(qū)分了三種不同的細(xì)胞系，并利用完整的 N-糖肽譜發(fā)現(xiàn)了小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）的區(qū)域異質(zhì)性，表明其在生物和生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用潛力。

圖6 單細(xì)胞和微量細(xì)胞中完整 N - 糖肽的分析

(A) 從單個(gè)、10 個(gè)和 50 個(gè) HeLa 細(xì)胞以及 50ng HeLa 酶解物中獲得的完整 N - 糖肽數(shù)量。(B) 從大量 HeLa 酶解物和單個(gè) HeLa 細(xì)胞中累積鑒定出的 N - 糖肽。(C) 強(qiáng)度比較。(D) 從單個(gè)、10 個(gè)和 50 個(gè) HeLa 細(xì)胞以及 50ng HeLa 酶解物中獲得的 N - 糖肽的變異系數(shù)（CV）分布（n = 7）。(E) 來(lái)自三種細(xì)胞系的 N - 糖肽的主成分分析（n = 14）。(F) 單個(gè) HeLa 細(xì)胞的 N - 糖肽的無(wú)監(jiān)督層次聚類(lèi)（點(diǎn)擊查看大圖）

綜上所述，基于等壓標(biāo)記TMT的載體策略，作者使用高場(chǎng)非對(duì)稱波形離子遷移譜儀FAIMS聯(lián)用Orbitrap Exploris 480 質(zhì)譜儀進(jìn)行非富集單細(xì)胞N-糖肽分析。使用從大量細(xì)胞樣本中獲得的 N-糖肽作為載體通道，顯著提高了 N-糖肽的 “總” 信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè) HeLa 細(xì)胞平均260個(gè) N-糖肽的首次定量分析。

總結(jié)

由于翻譯后修飾的豐度極低、現(xiàn)有的富集策略與前處理方案存在不兼容且缺乏靈敏的檢測(cè)方案等因素的存在，在單細(xì)胞水平上對(duì)翻譯后修飾進(jìn)行大規(guī)模分析仍然極具挑戰(zhàn)性。隨著單細(xì)胞樣品前處理技術(shù)以及高端質(zhì)譜檢測(cè)器性能的突飛猛進(jìn)，在無(wú)需特定富集方案的前提下進(jìn)行翻譯后修飾分析已成為可能。基于載體蛋白組的SCoPE-MS策略能夠提高整體樣品的蛋白質(zhì)含量，從而降低對(duì)LC-MS系統(tǒng)的靈敏度要求。此外，當(dāng)前已有最高通量為32 plex的TMT標(biāo)簽，在不加入載體蛋白質(zhì)的情況下能夠同時(shí)對(duì)32個(gè)樣本進(jìn)行相對(duì)定量分析，能夠顯著提升單細(xì)胞蛋白質(zhì)（修飾組）的分析通量[3]。相信未來(lái)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)單細(xì)胞修飾搜索算法的優(yōu)化，基于無(wú)損樣品前處理在超高靈敏度質(zhì)譜系統(tǒng)Orbitrap Astral/Ascend Tribrid的加持下，單細(xì)胞修飾的鑒定將會(huì)迎來(lái)嶄新的局面。

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