高分辨氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)解析天然免疫受體構(gòu)象變化與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制

MDA5是細(xì)胞內(nèi)的異體RNA監(jiān)測(cè)蛋白，屬于RIG-I樣受體家族（RLRs）的重要成員。MDA5參與多種RNA病毒引起的免疫反應(yīng)，是天然免疫的一道重要屏障。RLRs家族共有RIG-I、MDA5及LGP2三個(gè)成員，其中RIG-I和MDA5的N端均擁有串聯(lián)CARDs結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)CARD-CARD同型相互作用招募MAVS，最終促進(jìn)I型干擾素（IFN）通路的激活。在RLRs抗病毒信號(hào)的激活過(guò)程中，K63連接的多聚泛素鏈（K63-polyUb）起著關(guān)鍵作用[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，短鏈K63-polyUb可以通過(guò)共價(jià)錨定和非共價(jià)錨定兩種方式有效地促使RIG-ICARDs的寡聚[2, 3]。形成的異源四聚體復(fù)合物（K63-polyUb-RIG-ICARDs）可激活MAVSCARD寡聚，形成MAVS纖維的核心[2, 3]。然而，K63-polyUb是如何調(diào)控MDA5 CARDs組裝以及招募、激活MAVS CARD的分子機(jī)制，仍是待解決的科學(xué)問(wèn)題。

Immunity

近期中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所鄭杰團(tuán)隊(duì)在Immunity雜志上以Research Article形式在線發(fā)表了題為“Ordered assembly of the cytosolic RNA-sensing MDA5-MAVS signaling complex via binding to unanchored K63-linked poly-ubiquitin chains"的研究成果，本研究通過(guò)生物大分子氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)（HDX-MS）以及冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-EM）揭示了長(zhǎng)鏈，非錨定K63-polyUb促進(jìn)MDA5-MAVS組裝程序與信號(hào)傳遞的分子機(jī)制。

MDA5-MAVS

首先

研究人員建立了K63-，K48-連接泛素鏈的生化合成平臺(tái)，并制備了不同長(zhǎng)度的K63-polyUbn（2≤n≤14）（圖1）。通過(guò)基于Orbitrap Fusion平臺(tái)的氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)（Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry，HDX-MS），研究人員發(fā)現(xiàn)MDA5CARDs和RIG-ICARDs的氫氘交換保護(hù)程度依賴于不同長(zhǎng)度的K63-polyUbn（MDA5: n≥8; RIG-I: n≥3）而不依賴于K48-polyUbn（n≥10）；并且保護(hù)強(qiáng)度隨著K63-polyUb的長(zhǎng)度增加而特異性加強(qiáng)。

圖1：HDX-MS分析K63-polyUb（2≤n≤14）對(duì)RLR CARDs寡聚的影響（點(diǎn)擊查看大圖）

為了研究K63-polyUbn介導(dǎo)的MDA5CARDs寡聚體的組裝機(jī)制，研究人員利用冷凍電鏡首次解析得到了分辨率為3.3?的MDA5CARDs與K63-polyUb13復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。這也是MDA5CARDs第一個(gè)近原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

那么MDA5CARDs-K63-polyUbn異源四聚體又是如何招募其下游信號(hào)蛋白MAVS？

研究人員進(jìn)一步通過(guò)Cryo-EM解析得到了分辨率為3.2?的由長(zhǎng)鏈K63-polyUb11拴系的“自下而上"的左手螺旋MDA5CARDs-MAVSCARD復(fù)合體結(jié)構(gòu)。

同時(shí)

研究人員通過(guò)生物大分子氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)，首次證明了人類MDA5全長(zhǎng)蛋白的CARDs在初始狀態(tài)下處于張開(kāi)的構(gòu)象并可與長(zhǎng)鏈K63-polyUb10結(jié)合。然而在早期研究中，氫氘交換質(zhì)譜已經(jīng)證明了RIG-ICARDs在初始狀態(tài)下呈閉合的構(gòu)象[4, 5]。這也直接證明了RIG-I和MDA5的CARDs在溶液狀態(tài)下構(gòu)象上的巨大差異。其次，研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)K63-polyUb10拴系的MDA5CARDs復(fù)合物在溶液中的穩(wěn)定性受MDA5的RNA依賴的ATP酶活性別構(gòu)調(diào)節(jié)。

圖2：HDX-MS分析全長(zhǎng)MDA5在其識(shí)別配體或底物作用下（dsRNA/ATP/K63-polyUb）的動(dòng)態(tài)的構(gòu)象變化與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（點(diǎn)擊查看大圖）

綜上所述

該研究通過(guò)生物大分子氫氘交換質(zhì)譜和冷凍電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈，非錨定K63-polyUb類似于一個(gè)“分子橋梁"，促進(jìn)了MDA5CARDs四聚體的組裝，使之形成一個(gè)激動(dòng)狀態(tài)的構(gòu)象來(lái)招募下游MAVSCARD，以進(jìn)一步促進(jìn)MAVSCARD的寡聚和激活（圖2）。激活狀態(tài)下的MDA5可以結(jié)合并水解ATP，遠(yuǎn)程提升CARDs-K63-polyUb10的穩(wěn)定性以持續(xù)激活MAVS。該研究彌補(bǔ)了MDA5通路激活與信號(hào)傳導(dǎo)研究的空白，進(jìn)一步揭示了長(zhǎng)鏈，非錨定K63-polyUb在細(xì)胞內(nèi)作為內(nèi)源性激動(dòng)劑的免疫學(xué)功能，為理解泛素分子多樣性在抗RNA病毒天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)與調(diào)控中的作用提供了新的線索。

* 上海藥物所博士后宋斌和美國(guó)NIH Research Associate陳運(yùn)為論文第一作者，上海藥物所鄭杰研究員為論文的通訊作者。該工作得到了新加坡南洋理工大學(xué)羅大海教授、吳彬教授，美國(guó)Scripps研究所Patrick Griffin教授，上海藥物所羅成研究員和張乃霞研究員的大力支持，得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、上海市浦江人才計(jì)劃等項(xiàng)目的支持。

專家訪談

鄭杰（中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所 研究員）

Q

根據(jù)您的經(jīng)驗(yàn)對(duì)氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)的理解？以及這篇文章的主要的難點(diǎn)在哪里？

答：我覺(jué)得HDX-MS是基于生物化學(xué)這個(gè)學(xué)科，圍繞表征酶活反應(yīng)機(jī)理的一個(gè)很實(shí)用的技術(shù)，HDX-MS第一個(gè)應(yīng)用是來(lái)自美國(guó)工業(yè)界，可以很好地應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)。這個(gè)新工作的一個(gè)難點(diǎn)就是采用生化合成了不同長(zhǎng)度的K63多聚泛素鏈，并對(duì)RLR CARDs進(jìn)行了后續(xù)功能篩選和表征。如果無(wú)法系統(tǒng)合成K63-polyubn（n＞8），我們也無(wú)法解決這個(gè)科學(xué)問(wèn)題。

Q

基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)的HDX-MS技術(shù)作為捕捉蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象變化的重要研究工具，相對(duì)于冷凍電鏡技術(shù)提供哪些*的生物學(xué)信息？

答：HDX-MS和cryoEM提供的信息非?；パa(bǔ)，首先，兩者聯(lián)用可以提供高分辨的結(jié)構(gòu)和溶液中動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化的信息。其次，在我們這個(gè)研究中，我們使用了HDX-MS去表征MDA5全長(zhǎng)蛋白的一系列的構(gòu)象變化，這對(duì)cryoEM研究是很有難度的，因?yàn)槿L(zhǎng)MDA5 的CARDs和Helicase之間的linker長(zhǎng)度達(dá)到了120個(gè)氨基酸且在溶液中是非?；钴S的，我們這次利用了HDX分析了MDA5與RNA，ATP互作如何遠(yuǎn)程調(diào)控CARDs與K63-polyub的構(gòu)象變化。表征好這一系列的構(gòu)象變化就是表征MDA5在溶液狀態(tài)下是如果進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制。

Q

HDX-MS技術(shù)目前有哪些應(yīng)用方向，未來(lái)應(yīng)用前景如何？

答：HDX-MS捕捉的是溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的信息，研究蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)，這對(duì)藥物發(fā)現(xiàn)（drug discovery）研究非常關(guān)鍵，可以大大加速藥物的發(fā)現(xiàn)與研發(fā)。HDX-MS可以直接提供藥物與小分子互作，以及生物大分子抗體藥物識(shí)別抗原等研究提供接近生理意義的重要信息。我博士后是在美國(guó)Scripps研究所Patrick Griffin教授進(jìn)行的訓(xùn)練，當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)室的同事很多都去了美國(guó)大藥企利用HDX-MS參與藥物發(fā)現(xiàn)。其中Mike還在禮來(lái)公司搭建了一套高通量全自動(dòng)的HDX設(shè)備，專門為禮來(lái)的小分子藥物發(fā)現(xiàn)篩選而設(shè)定。回國(guó)后我們也正朝著這個(gè)方向努力，實(shí)現(xiàn)HDX-MS軟件和硬件的進(jìn)一步自動(dòng)化，希望未來(lái)在國(guó)內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)HDX-MS高通量。

另一個(gè)努力的方向是早日實(shí)現(xiàn)單氨基酸殘基分辨率的HDX-MS技術(shù)的升級(jí)，這可以 幫助精準(zhǔn)表征藥物作用關(guān)鍵氨基酸殘基。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，HDX-MS的自動(dòng)化進(jìn)樣平臺(tái)機(jī)械臂模塊需要一定的改造，比如更嚴(yán)格的控溫，更高頻率的連續(xù)進(jìn)樣來(lái)優(yōu)化質(zhì)譜的采集效率。

最終我希望可以利用高通量HDX-MS平臺(tái)去建一個(gè)蛋白庫(kù)，提供氫鍵，自由能，單氨基酸殘基HDX等可以量化的參數(shù)，更精準(zhǔn)的幫助科研工作者了解蛋白質(zhì)的折疊，去折疊等穩(wěn)態(tài)的信息。

關(guān)于作者

中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所鄭杰實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期結(jié)合生物大分子氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)交叉解決由蛋白質(zhì)（酶）的動(dòng)力學(xué)異常變化所導(dǎo)致的重大疾病的發(fā)生機(jī)制，聚焦RNA天然免疫模式識(shí)別受體的內(nèi)源，外源性配體識(shí)別與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，以及自身免疫疾病發(fā)生機(jī)制。圍繞氫氘交換及其應(yīng)用，以第一作者或通訊作者在Immunity 2021，Anal Chem 2019，Nat Commun 2018，structure 2018， Nat Commun 2017，Nucleic Acids Res 2015等期刊上。

感謝鄭杰老師對(duì)本文的指導(dǎo)與支持

參考文獻(xiàn)：

1. Hu, H. and S.C. Sun, Ubiquitin signaling in immune responses. Cell Res, 2016. 26(4): p. 457-83.

2. Zeng, W., et al., Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell, 2010. 141(2): p. 315-30.

3. Peisley, A., et al., Structural basis for ubiquitin-mediated antiviral signal activation by RIG-I. Nature, 2014. 509(7498): p. 110-4.

4. Zheng, J., et al., High-resolution HDX-MS reveals distinct mechanisms of RNA recognition and activation by RIG-I and MDA5. Nucleic Acids Res, 2015. 43(2): p. 1216-30.

5. Zheng, J., et al., HDX-MS reveals dysregulated checkpoints that compromise discrimination against self RNA during RIG-I mediated autoimmunity. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5366.