縱觀近年來全球生物制藥行業(yè)的發(fā)展趨勢，單克隆抗體所占shichang份額越來越高，艾伯維公司的阿達木單抗注射液更是多年穩(wěn)坐全球銷售額“藥王"的寶座，帕博利珠、烏司奴和納武利尤等多個單抗產品也均在2021年全球藥品jian端|銷售額T OP100中占有一席之地。

由于蛋白類藥物的電荷異質性可能導致生產過程中的產品降解等，從而對產品的安全性和有效性造成影響，所以對蛋白類藥物的電荷變異體深入表征和評估是十分必要的。目前已知多種修飾會導致電荷變異體的產生，除常見的C端賴氨酸丟失、N端焦谷氨酸環(huán)化、脫酰胺化、氧化和糖基化等修飾外，還有多種可能的修飾會影響蛋白質的等電點（Isoelectric point, pI），進而影響蛋白的電荷異質性。所以采用先進的分析技術對電荷變異體進行分離和深入表征就顯得尤為必要。

全柱成像等電毛細管聚焦電泳（ Imaged capillary isoelectric focusing, icIEF）技術由于其通量高、易于使用、方法開發(fā)快速和重現性好等優(yōu)點，已經被廣泛用于治療性蛋白產品的開發(fā)和生產過程中。而將高分辨質譜與icIEF平臺聯合使用，可以充分發(fā)揮二者的優(yōu)點，從而使治療性蛋白產品的高效分離和深入表征成為可能。

在本文的工作中，通過將iCIEF技術與高分辨質譜聯合使用，我們對帕博利珠這一人源化IgG4單克隆抗體的電荷變異體分別進行了完整分子量層面和肽圖層面的表征。我們使用的CEInfinite iCIEF平臺（來自于Advanced Electrophoresis Solution Ltd., AES有限公司）除了高質量的iCIEF-UV功能外，還可以與高分辨質譜直接在線串聯，測定電荷變異體的分子量，無需額外轉換接口，且該平臺從質譜直連模式轉換為全自動的餾分收集模式也非常簡便快捷，無需安裝/拆xie任何模塊。

圖1A為iCIEF-MS直連模式的工作原理圖，圖1B則為餾分收集模式工作原理圖。

(B)

圖1. CEInfinite iCIEF平臺工作原理圖。

(A) iCIEF-MS 直連模式。(B) 餾分分離及收集模式。

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iCIEF-MS直連模式的優(yōu)點之一就是無需繁瑣的樣品前處理步驟，可以在研發(fā)/生產的任意階段獲取樣品后，快速進行完整分子量層面的電荷變異體監(jiān)控。下圖2及圖3展示了我們使用iCIEF-MS直連技術分析帕博利珠單抗電荷變異體的結果，可見即使是pI僅差0.02的堿峰B1和主峰，也可以在iCIEF上得到基線分離(圖2)，隨后的高分辨質譜分子量測定結果顯示該堿峰與主峰相比，主要差異是其中一條重鏈的N端未發(fā)生焦谷氨酸環(huán)化。另外觀察原始質譜譜圖不難發(fā)現，得益于Orbitrap高分辨質譜的靈敏度，即使是強度比主峰低2~3個數量級的堿峰B3，仍可得到糖型分布清晰的譜圖，并可通過解卷積觀察到該峰中各個組分的分子量（圖3）。表1展示了iCIEF-MS直連測得的每個峰中主要的電荷變異體種類。

圖2. (A)帕博利珠 iCIEF- UV 分離譜圖。(B) 帕博利珠單抗各個電荷變異體百分含量，上樣量為柱上1.6μg。A1-A4, 酸峰; Main, 主峰; B1-B3, 堿峰。

圖3. iCIEF-MS在線直聯分析帕博利珠電荷變異體。

(A)，主峰與所有堿峰原始質譜圖對比。(B)，堿峰B1(pI=7.59)與主峰(pI=7.57)解卷積結果鏡像圖對比。(C)，基于肽圖得到的主峰和堿峰B1重鏈N端焦谷氨酸環(huán)化比率。(D)，堿峰B3解卷積結果。

表1 iCIEF-MS在線直聯鑒定帕博利珠電荷變異體。HC，重鏈。

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通過iCIEF-MS在線直連對帕博利珠單抗的電荷變異體進行分離并測定其完整分子量后，為了對電荷變異體進行更加深入的表征，我們使用CEInfinite iCIEF平臺的餾分收集功能，對其電荷變異體的每個峰離線收集后進行酶解，隨后上樣至高分辨液質聯用平臺進行肽圖分析。圖4展示了離線餾分收集及餾分純度的確認過程。在餾分收集過程中，得益于iCIEF平臺分離良好的穩(wěn)定性，可以通過預實驗確定每個峰的出峰時間后，設定隊列自動進行循環(huán)收集，從而節(jié)省實驗室人力，提高收集通量。

在我們的實驗中，根據預實驗結果，選定五個峰（兩個酸峰，兩個堿峰以及主峰）進行收集，總共進行了20針重復進樣，每針上樣量為8μg，將多針重復進樣的相同峰進行合并，即使是含量很低的電荷異質體，也能夠收集到足夠量的蛋白進行后續(xù)分析。

圖4A展示的是其中10針進樣的譜圖重疊，可見系統具有良好的重現性。圖4B中展示了每個峰的峰面積相對含量（以所有峰面積總和為100%計，下同），可見有三個酸/堿峰的峰面積相對含量均小于10%，其中酸峰A2的峰面積相對含量只有2.40%。無論是相對含量最高的主峰，還是低含量的酸/堿峰，多針重復進樣峰面積CV值均小于7%，證明了系統良好的重現性。圖4C是取了五針重復進樣收集后合并的餾分進行峰純度的確認，可見不同的峰之間均得到了良好分離。

圖4. 離線餾分收集及餾分純度的確認。

(A) 餾分收集,10針重復進樣UV譜圖重疊。(B）每個峰的在所有峰中的相對百分含量，以峰面積計算。(C) 離線收集的五個餾分，重新進樣以確認峰純度。

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圖5展示了主峰肽圖覆蓋率及色譜圖。離線收集的餾分經胰酶酶切，輕重鏈均可達到98%以上覆蓋率，且所有肽段均包含二級譜圖信息。色譜分離良好，絕大多數色譜峰中包含的肽段均得到了鑒定。

圖5 主峰（pI=7.57）序列覆蓋度以及色譜圖。

(A)，序列覆蓋度。(B)，色譜圖。綠色陰影部分表示該色譜峰中的肽段來源于輕鏈，粉色陰影部分表示該色譜峰中的肽段來源于重鏈。

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通過對收集到的五個峰分別酶解，隨后進行UHPLC-MSMS肽圖分析，我們對每個峰中重鏈末端、糖型和側鏈常見PTM的變化趨勢進行了深入研究。圖6展示的是末端修飾的變化情況。由于重鏈C端賴氨酸丟失、輕/重鏈N端焦谷氨酸環(huán)化等修飾會對產品的電荷異質性產生影響，分析科學家們通常都會對這些修飾進行監(jiān)控。從圖6中不難發(fā)現，相較于酸峰和主峰，兩個堿峰中重鏈C端賴氨酸丟失的比率均有較為明顯的下降。另外堿峰B1中焦谷氨酸環(huán)化比率明顯降低，只有30%左右，而其他的四個峰此修飾比率均在90%以上，這一結果也與前文中的質譜直連結果相吻合。圖6C中的焦谷氨酸環(huán)化肽段二級譜圖，碎片離子豐富，信噪比高，也證明了定性定量結果的可信度。

圖6. 所有峰中末端修飾定性定量結果。所有定量結果均為三針平行進樣的平均值，下同。

(A), 所有峰中賴氨酸丟失/焦谷氨酸環(huán)化比率對比。(B), 主峰中焦谷氨酸環(huán)化肽段二級碎片覆蓋圖。(C), 主峰中焦谷氨酸環(huán)化肽段二級譜圖。

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重鏈上的保守N糖基化位點的糖鏈修飾情況也是需要監(jiān)控的修飾之一。圖7中展示的是所有峰中N-糖鏈定性定量結果，可見在酸峰中，含有唾液酸的糖鏈比率上升，而堿峰中A1G0F和A2G0的相對含量有所增高。

圖7. 所有峰中N-糖鏈定性定量結果。局部放大圖，相對含量小于6%的糖型。

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已知脫酰胺化會對蛋白質的結構、折疊和聚集等造成影響，且單抗中某些關鍵位點的脫酰胺化可能會影響產品的安全性和有效性，所以對于關鍵位點的天冬酰胺，通常會將其脫酰胺化修飾作為CQA進行監(jiān)控。天冬酰胺脫酰胺反應是通過琥珀酰亞胺中間體進行的，故在監(jiān)控脫酰胺的同時，也會一并監(jiān)控琥珀酰亞胺化比率。此處以重鏈CDR區(qū)的N55為例展示其脫酰胺化和琥珀酰亞胺化的定性定量結果。脫酰胺通常會導致酸峰比例的增高，由實驗結果不難發(fā)現，相較于主峰，兩個酸峰中脫酰胺的比率均有顯著上升，分別為主峰中脫酰胺相對含量的4.86倍和5.26倍，且琥珀酰亞胺化比率的變化也呈對應趨勢（圖8）。

圖8. 主峰和酸峰中重鏈N55脫酰胺化及琥珀酰亞胺化定性定量結果。

(A), 修飾比率變化在主峰及酸峰中的分布。(B)，主峰和酸峰中未修飾/脫酰胺修飾肽段對比。

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氧化同樣也是可能影響產品安全性和有效性的翻譯后修飾之一，所以我們選取了重鏈CDR區(qū)、Fc區(qū)和可能會影響帕博利珠單抗與PD-1結合的數個甲硫氨酸位點監(jiān)控氧化比率變化情況。如圖9所示，在堿峰中均可觀測到甲硫氨酸氧化比率明顯上升。

圖9. 所有峰中選定甲硫氨酸位點氧化定性定量結果。

(A), 全局圖。(B)， 相對含量小于6%部分的局部放大圖。

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