離子色譜技術(shù)（Ion Chromatography, IC）作為進行離子型化合物分析的重要手段，被廣泛應用在食品、環(huán)境、 制藥、化工、科研等領(lǐng)域。Thermo Fisher Scientific在離子分析領(lǐng)域已有40多年的研究歷史，開創(chuàng)了現(xiàn)代離子色譜時代，幫助建立了眾多標準方法，惠及*范圍的科研工作者。應用在組學領(lǐng)域時，完整的惰性材料流路充分具備了系統(tǒng)的抗生物污染和金屬污染條件，可完成糖類、氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)和多肽的分離測定。

  本篇應用將從技術(shù)方案出發(fā)，為你介紹離子色譜技術(shù)及串聯(lián)Orbitrap高分辨質(zhì)譜應用于代謝組學研究的優(yōu)勢，應對代謝組學研究中離子型和極性代謝物分析的挑戰(zhàn)。

1 代謝組學的挑戰(zhàn)：

1.1 提高代謝物譜的檢測范圍

  代謝組學的研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)，包括代謝物的前體、衍生物和具有一定濃度的降解產(chǎn)物，它們都多樣性且變化迅速。如何提高代謝物譜的檢測范圍一直是代謝組學研究中挑戰(zhàn)之一。研究者往往需要采用一些互補的檢測技術(shù)，如液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）中的HILIC、RPLC，氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）以及核磁共振（NMR）技術(shù)，來覆蓋不同化學性質(zhì)的代謝物。

1.2 極性代謝物/離子化合物分析

  作為代謝組學領(lǐng)域重要的研究對象，糖酵解途徑代謝產(chǎn)物、三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物以及核酸化合物，因其重要的生物學功能，研究越來越受到重視。以往這類化合物的檢測，研究者多采用GC-MS技術(shù)，但由于這些代謝物的極性強、揮發(fā)性低，往往需要進行衍生化處理，大大增加研究者的工作量和數(shù)據(jù)挖掘過程中的不確定性。離子色譜作為液相色譜的一種，對糖類、氨基酸、核酸、有機酸等物質(zhì)的分析起著重要的作用。

1.3 同位素干擾

  在代謝組學zui前沿的技術(shù)——代謝流分析中，采用“同位素示蹤”實驗來追蹤標記的重同位素在代謝網(wǎng)絡中的流向，通過測定代謝網(wǎng)絡中的代謝物被同位素標記的情況，從而可以更好的揭示代謝物的產(chǎn)生、流向，幫助代謝通路研究更清晰、更準確，逐漸成為代謝組學研究中的熱點技術(shù)。但在實際應用中，卻存在一定的技術(shù)瓶頸，當標記的重同位素和基質(zhì)中的質(zhì)譜峰發(fā)生重疊時，容易出現(xiàn)假陽性的測定結(jié)果，同時影響定量的準確性。

2. 應用解決方案

  Thermo Scientific 在離子分析領(lǐng)域已有40多年的研究歷史。40多年來，賽默飛世爾科技始終作為離子色譜的，著整個離子色譜市場的發(fā)展方向。Thermo Scientific™ Integrion 系統(tǒng)和Thermo Scientific™ ICS-5000+高壓離子色譜系統(tǒng)，是賽默飛推出的研究級多功能離子色譜系統(tǒng)。通過其的離子色譜抑制器技術(shù)，可與質(zhì)譜直接相串聯(lián)，zui大程度提高痕量組分檢測的靈敏度，以及對共流出組分的確證能力。

Thermo Scientific™ Integrion高壓離子色譜系統(tǒng)：

• *耐壓zui高的離子色譜泵，耐壓高達6000 psi；

• HPIC 淋洗液自動生成

• 全面兼容4 μm 小粒徑色譜柱，分析速度更快；

• 極大提升了峰容量，進一步優(yōu)化了分離能力。

 Thermo Scientific™ ICS-5000+高壓離子色譜：

• 世界上毛細管高壓、“只加水”離子色譜系統(tǒng)；

• 單系統(tǒng)和雙系統(tǒng)的靈活性配置，支持多種檢測器；

• 兼容毛細管、微孔和標準體系，色譜分析更加靈活；

• 出色的耐壓性能，支持小粒徑色譜柱分離，大大提高了分辨率；

• 綠色理念離子色譜：毛細管色譜模式下，淋洗液發(fā)生器可以連續(xù)使用18個月，一年僅消耗5.25 L水，極大降低了試劑的消耗；

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2.1 離子色譜抑制器技術(shù)——離子色譜聯(lián)用質(zhì)譜成為可能

  在離子色譜流動系統(tǒng)中，待分析物以及淋洗液中的可離解物質(zhì)均以離子狀態(tài)存在，而質(zhì)譜儀的接口對酸、堿、金屬鹽的耐受度較低，一直制約著離子色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展。離子色譜的抑制器組件將淋洗液中的反離子除去（如陰離子分析中，除去陽離子）。將淋洗液近乎轉(zhuǎn)變?yōu)樗芤?，從根本上解決了離子色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的接口技術(shù)難題。

2.2 在線電解淋洗液發(fā)生器技術(shù)

  賽默飛世爾科技提供免化學試劑的在線電解淋洗液發(fā)生器技術(shù)，免化學試劑（RFIC）為賽默飛的技術(shù)，多次榮獲大獎（2002年匹茲堡銀獎、2003年匹茲堡金獎、2005年匹茲堡銀獎）。

  在線電解淋洗液發(fā)生器是RFIC離子色譜系統(tǒng)的心臟。通過電解水在線得到高純度的淋洗液，實現(xiàn)線性梯度。相比傳統(tǒng)方法，不再需要購買價格昂貴的梯度泵，也不需要手工配制濃淋洗液，*避免了容器和試劑污染引起的基線背景升高。是離子色譜發(fā)展的重要里程碑。

3. 應用解決優(yōu)勢

3.1 優(yōu)異的分離能力

  Junhua Wang 等采用Thermo Scientific™ ICS HPIC串聯(lián)Q Exactive（Cap IC/Q Exactive）系統(tǒng)對頭頸部腫瘤代謝組學進行研究，Cap IC/Q Exactive系統(tǒng)顯示出出色的分離能力，與現(xiàn)有的檢測技術(shù)相比可以得到更全面的結(jié)果。以m/z=259.0224提取離子流圖為例，采用Cap IC/Q Exactive系統(tǒng)系統(tǒng)得到的結(jié)果中，可提取11個色譜峰（圖A）。相同條件下UHPLC（圖B）和HILIC（圖D） 模式的分離效果可滿足要求，但只有3個色譜峰。也就是說，采用常規(guī)檢測方法，將損失2/3的同分異構(gòu)體化合物。代謝物結(jié)構(gòu)上的改變往往帶來生物學功能發(fā)生很大的變化，越來越多代謝物的發(fā)現(xiàn)和檢測，有利于深入揭示細胞或生物體的代謝過程和代謝調(diào)節(jié)機制。

3.2 出色的靈敏度

  采用Thermo Scientific™ ICS HPIC串聯(lián)Q Exactive系統(tǒng)對21個標準品混標的檢測結(jié)果顯示，靈敏度相比HILIC和UHPLC模式提升約100倍。Cap IC/Q Exactive系統(tǒng)采用的色譜柱柱內(nèi)徑為0.4 mm，大大降低了離子在柱內(nèi)的擴散效應，極大增加了質(zhì)量靈敏度，檢出限可低至pg/mL。

3.3優(yōu)異的重現(xiàn)性

  Junhua Wang 等采用Cap IC 、HILIC、UHPLC三種模式串聯(lián)Q Exactive系統(tǒng)，連續(xù)6天對49個代謝物進行檢測分析。結(jié)果顯示三個無機離子Cl^-，CO3^2-及PO4^3-的響應強度的RSD%分別為5.5%,7.8%和6.0%，保留時間的RSD%分別為6.5%,8.0%和7.2%。代謝組學是一種尋找差異的科學研究，結(jié)果的準確性依賴于分析儀器的重現(xiàn)性。ICS HPIC系統(tǒng)經(jīng)過精心打造，使用RFIC-EG裝置，避免了人為誤差的引入，可極大的改善系統(tǒng)方法重現(xiàn)性結(jié)果。

3.4 Orbitrap質(zhì)量分析器消除同位素干擾

  通過檢測¹⁵N標記的谷氨酰胺（Glutamine，C₅H₁₀¹⁵N₂O₃）來追蹤生物胺在代謝通路中的流向研究中，谷氨酰胺和谷氨酸鹽（Glutamate，C5H9NO4）在反相色譜中存在共流出的情況，當儀器的分辨率滿足不了要求時（如傳統(tǒng)Q-TOF檢測器,R=20,000），¹⁵N標記的Glutamine和Glutamate質(zhì)譜峰發(fā)生重疊，容易出現(xiàn)假陽性的測定結(jié)果，同時影響定量的準確性。Orbitrap 技術(shù)是實現(xiàn)超高分辨率質(zhì)譜分析的*標準，使用Orbitrap質(zhì)量分析器，把儀器的分辨率提高到R=100,000時，¹⁵N標記的Glutamine和Glutamate質(zhì)譜峰信號達到基線分離，解決“同位素示蹤”實驗過程中的瓶頸。

總結(jié)

  賽默飛離子色譜技術(shù)在離子色譜行業(yè)一直處于地位，著整個離子色譜市場的發(fā)展方向。因其特殊的分離機理，在代謝組學研究中發(fā)揮著重要的作用。高分辨Orbitrap質(zhì)譜因其優(yōu)異的定性定量能力，結(jié)合了高分離能力的離子色譜和高選擇性的質(zhì)譜優(yōu)勢的IC-HRAM分析方法，可以簡單的色譜條件應對各類復雜基質(zhì)挑戰(zhàn)，是代謝組學樣品，特別是離子型和極性代謝物檢測的理想選擇。

參考文獻：

1. Wang J, Christison TT, Misuno K, et al. Metabolomic profiling of anionic metabolites in head and neck cancer cells by capillary ion chromatography with Orbitrap mass spectrometry. Anal Chem. 2014 May 20;86(10):5116-24.

doi: 10.1021/ac500951v. Epub 2014 May 9.

2. Hu S, Wang J, Ji EH, et al. Targeted Metabolomic Analysis of Head and Neck Cancer Cells Using High Performance Ion Chromatography Coupled with a Q Exactive HF Mass Spectrometer. Anal Chem. 2015 Jun 16;87(12):6371-9

doi: 10.1021/acs.analchem.5b01350. Epub 2015 May 22.

3. Jan C van Dam, Michael R Eman, Johannes Frank, et al. Analysis of glycolytic intermediates in Saccharomyces cerevisiae using anion exchange chromatography and electrospray ionization with tandem mass spectrometric detection. Analytica Chimica Acta. 460 (2002) 209–218

doi.org/10.1016/S0003-2670(02)00240-4