一、實驗原理

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是通過蛋白質和SDS形成復合物后，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，不同大小分子遷移率不同，達到分離蛋白質的目的。

在蛋白質溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質分子中二硫鍵還原，使多肽組分分成單個亞單位；SDS能使蛋白質的氫鍵、疏水鍵打開，并結合到蛋白質分子上，形成蛋白質-SDS復合物。

在一定條件下，SDS與大多蛋白質的結合比為1.4g SDS :1g蛋白質。由于SDS帶有大量負電荷，當它與蛋白質結合時，消除或掩蓋了不同種類蛋白質間原有電荷的差異，使各種蛋白質的SDS復合物都帶上相同密度的負電荷。SDS與蛋白質結合后，還引起了蛋白質構象的改變。SDS-蛋白質復合物的流體力學和光學性質表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度一樣，約為18Å，而長軸則隨蛋白質的相對分子質量成正比地變化。由于蛋白質的遷移率與蛋白質的凈電荷量成正比，與蛋白質在溶液中的摩爾系數(shù)成反比，而不同的SDS-蛋白質復合物都帶有相同密度的負電荷，并具有相同形狀；因此在一定濃度的凝膠中，由于分子篩效應，則電泳遷移率就成為蛋白質相對分子質量的函數(shù)。

現(xiàn)在常用的SDS-PAGE系統(tǒng)有好幾種，緩沖液系統(tǒng)有連續(xù)和不連續(xù)之分，凝膠形狀可以是柱狀，也可以是平板狀。本實驗采用的是不連續(xù)垂直板電泳，此系統(tǒng)分辨率高，便于電泳樣品間的相互比較，是目前科研工作中廣泛采用的一個系統(tǒng)。

二、實驗用品

（一）器材

（1）垂直管電泳槽和玻管。

（2）恒壓恒流電泳儀。

（3）酸度計

（二）試劑  

（1）標準蛋白質：可采用廠家生產(chǎn)的不同相對分子質量范圍的SDS-PAGE標準蛋白質試劑盒，也可參考常用的標準蛋白質相對分子量表，從中選擇3~5種蛋白質，按照每種蛋白0.5~1mg/ml溶解液，自己配制標準蛋白質混合試劑。

（2）凝膠貯液：丙烯酰胺30g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色試劑瓶中，4℃貯存。

（3）10% SDS溶液:稱5gSDS,加重蒸水至50ml，微熱使其溶解，置試劑瓶中，4℃貯存。在低溫下易析出結晶，用前微熱，使其*溶解。

（4）電極緩沖液：稱Tris6.0g,Gly28g,加10%SDS 10ml,加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。

（5）樣品溶解液：內含1%SDS,1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍，0.01mol/LPH6.7Tris.Hcl緩沖液。。

（三）材料

待測的已純化的蛋白質樣品。

三、實驗程序

（一）操作方法

 1.凝膠柱的制備

預先準備潔凈的玻管兩根，玻璃管的一端插在青霉素或疫苗小瓶的橡皮帽中，使其垂直站立在桌面上或管架中。

將配好的凝膠溶液用細長頭滴管加到預先準備好的玻管中，至離上端1cm處，再用注射器緩緩加水3~5mm高，靜止聚合30min,待凝膠與水層之間出現(xiàn)折射率不同的界面時，說明凝膠聚合，再放置0.5h，待聚合*。

2. 凝膠板的制作

將混合后的分離膠溶液，用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm.用1ml注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水，用于隔絕空氣，使膠面平整。約30min后，可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線，則表示凝膠*聚合。傾去水封層的蒸餾水，用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。用細長頭的滴管將混合均勻的濃縮膠加到長、短玻璃板的窄縫內距玻璃上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。靜置電泳槽，10min左右上膠即可聚合，再放置10~20min,加入PH８.３的Tris甘氨酸電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5cm,輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。

3、樣品的處理

根據(jù)標準相對分子質量蛋白試劑盒的要求加樣品溶解液，自己配制的標準及末知樣品，按0.5~1mg/ml加樣品溶解液，溶解后，將其轉移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子，在100℃沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫時不用，可放在-20℃冰箱保存較長時間，使用前在100℃沸水中加熱3min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合 。

4.加樣

加樣的體積要根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為10~15µL，若樣品較稀，加樣體積可達100µL，但注意樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡可用注射器針頭挑除。加樣時，將微量進樣器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內盡量接近底部，注意針頭不要碰破凹膠面，輕輕加入樣品。由于樣品溶解液中含有比較比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶解液會自動沉降在凝膠表面形成樣品層 。

5. 電泳

 將電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接，接通冷卻水，打開電泳儀開關，開始時電流為10mA,待樣品進入分離膠后，將電流調至20~30mA,當溴酚藍染料距硅膠框1cm時，停止電泳，關閉電源及冷卻水。

6. 染色與脫色

電泳結束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，在兩側溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。將凝膠板放入大培養(yǎng)皿中，加入染色液染色1~2h，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直至蛋白質區(qū)帶清晰，即可計算相對遷移率。

7. 繪制標準曲線

將大培養(yǎng)皿放在一張坐標紙上，量出加樣端距細銅絲間的距離以及各蛋白質樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離，按下式計算相對遷移率mR：

  相對遷移率=蛋白樣品距加樣端遷移距離/溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離

以標準蛋白的相對遷移率為橫坐標，標準蛋白質相對分子量為縱坐標在半對數(shù)坐標紙上作圖，可得到一條標準區(qū)線。根據(jù)末知蛋白質樣品相對遷移率可直接從標準曲線上查出其相對分子質量。

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