動(dòng)物組織DNA的制備

一、實(shí)驗(yàn)原理

提取核酸的基本程序包括細(xì)胞破碎-解聚核蛋白并去除蛋白質(zhì)-沉淀核酸并去除其它雜質(zhì)三步。破碎細(xì)胞的方法很多，高等動(dòng)植物材料常用液氮研磨法。

核蛋白利用DNA核蛋白在0.14mol/L Nacl鹽溶液的溶解度很低的特點(diǎn)而實(shí)驗(yàn)其與RNA核蛋白分離，殘存的RNA經(jīng) R Nase水解而去除。

蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解，并經(jīng)苯酚、Trichloromethane變性而分開。提純過程中的DNA酶活性經(jīng)低溫操作并用SDS解聚或檸檬酸三鈉和EDTA^.Na2等螯合劑抑制。逐漸純化的DNA經(jīng)乙醇或異丙醇沉淀而收集，終實(shí)現(xiàn)DNA分離純化之目的。

二、實(shí)驗(yàn)用品

  （一）器材

（1）離心機(jī)。

（2）水浴鍋。

（3）紫外分光光度計(jì)。

（4）研缽、液氮、帶蓋離心管。

（二）試劑  

（1）蛋白酶K:用水或TEN9溶液溶解成10mg/ml，或直接用粉末。

（2）TEN9 pH9.0:稱取Tris6.05g EDTA^.Na₂37.224g和NaCL 11.688g按順序溶于蒸餾水中，以HCL調(diào)PH9.0。

（3）TE溶液：50mmol/L Tris.HCL(PH8.0)-10mmol/L EDTA^.Na₂(PH8.0)。

（4）SS-phenol:以Tris平衡重蒸酚至PH8.0，加入0.1%的8-羥基喹啉（使溶液呈黃色，防止酚的氧化）。

（5）1mmol/L Tris.HCL(PH8.0)：Tris121.14g溶解于蒸餾水中，以HCL調(diào)PH至8.0定容至1L。

（6）20% SDS:20g SDS溶于100ml蒸餾水中，配制時(shí)要小心，SDS對(duì)呼吸道有強(qiáng)烈的刺激，且毒性較大。

（7）RNase A 若試劑含有痕量DNase，用*℃ 10min滅活DNase。

（8）3mol/L NaAc,pH6.5:稱取NaAc^.3H₂O408.1g溶于蒸餾水中，HAc調(diào)PH至6.5后定容至1L。

   TEN9、 Tris.HCL、NaAc均需高壓滅菌。

（三）材料

    新鮮兔肝或雞肝。

二、實(shí)驗(yàn)程序

（一）操作方法

 1.操作步聚

 （1）在液氮存在的條件下，于研中將5g動(dòng)物組織碾成細(xì)粉（約需20~30min）。

 （2）待液氮揮發(fā)后，將細(xì)粉轉(zhuǎn)至50ml帶蓋的離心管中，加入20mlTEN9和RNase(100µg/ml),混合均勻，加入1ml 20%SDS，將離心管上下顛倒幾次，并繼續(xù)輕揺10min。

（3）加入10mg蛋白酶K粉末，慢速攪拌使之溶解并混勻。

（4）在37℃至55 ℃保溫2~4小時(shí)，其間不時(shí)地輕搖。

（5）如需要，再加入10mg蛋白酶K粉末，繼續(xù)保溫至少2h，使組織充分消解。

（6）加入20ml SS-phenol,溫和顛倒離心管，使兩相充分混合，形成類似乳濁液狀。

（7）室溫，10000r/min離心10min，使混合液清晰分相（如分層不明顯，可適當(dāng)加大離心力及離心時(shí)間）。上層水相含DNA，中間為變性蛋白質(zhì)，下層為酚相。

（8）用大口吸管將上層水相轉(zhuǎn)至另一只離心管中，棄去界面相和酚相。

（9）將第6~8步重復(fù)進(jìn)行幾次，直至中間相*消失（蛋白質(zhì)必須去除干凈，否則對(duì)DNA的溶解及酚切都不利）。

(10)離心后，將水相轉(zhuǎn)到透析袋中以去除小分子物質(zhì)。在TE中透析（稀釋因數(shù)應(yīng)大于1000，稀釋因數(shù)指外界溶解與待透析液體積比的累積乘積），并用磁力攪拌器攪拌，提高透析效率，2h后轉(zhuǎn)至4℃繼續(xù)透析4h或過液（開始時(shí)，溶液中含大量的SDS，低溫下易析出，因此開始時(shí)必須先在溫室透析，由于透析袋較昂貴，用后可用TE浸泡，煮沸10min,可續(xù)用），可靜止透析。

（11）將透析后的溶液轉(zhuǎn)至50ml離心管中，加入NaAc溶液，使其終濃度為0.3mol/L,再加入0.8體積的異丙醇，溫和混勻（亦可用2倍體積的乙醇代替異丙醇，但可能使沉淀體積過大）。

（12）用玻璃棒繞起或鉤出呈現(xiàn)纖維狀的DNA，由于異丙醇不易干燥，可用70%的乙醇快速?zèng)_洗干燥后，在2~5ml TE中*溶解，并置冰箱保存。

（13）測定此DNA溶液在260nm和280nm波長下的OD值，此值應(yīng)大于1.7.如果小于1.7，則說明含較多的蛋白，需加少量蛋白酶K保溫后，用SS-酚進(jìn)一步抽提。另外，235nm處為鹽類及小分子化合物的吸收峰，因此應(yīng)大于1.7。

2得率的計(jì)算

由于1OD₂₆₀的DNA濃度為50µg/ml，因此DNA得率可按下公式計(jì)算：

1g新鮮組織的DNA含量=OD₂₆₀×50×溶解體積/組織鮮重（µg DNA/g）。

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