一、實(shí)驗(yàn)原理

植物DNA的制備與動(dòng)物DNA制備原理大致相同，為獲得高相對(duì)分子質(zhì)量DNA，應(yīng)取幼嫩組織或組織培養(yǎng)物為材料，常以液氮冷凍下研磨的方法破組織和細(xì)胞。

由于植物材料DNase水平低，蛋白含量較少，其操作要求是要克服植物次生代謝物如多酚、類黃酮和植物多糖與DNA共存對(duì)制備的影響。

二、實(shí)驗(yàn)用品

  （一）器材

（1）冰凍高速離心機(jī)。

（2）液氮罐。

（3）臺(tái)式離心機(jī)。

（4）電熱恒溫水浴鍋。

（5）電熱恒溫培養(yǎng)箱。

（6）電冰箱，離心管和tip。

（二）試劑  

（1）5mol/L Nacl：稱取NaCL 146.10g用蒸餾水定容至500ml。

（2）CTAB(十六烷基*基溴化銨)緩沖液。

      A.2mol/L Tris^.HCL緩沖液（pH8.0）：24.2g Tris溶于80ml重蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，用重蒸水定容至100ml。

      B.0.5mol/L EDTA緩沖液（PH8.0）：取186.12g EDTA.Na2用重蒸水800ml溶解，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，加重蒸水至1000ml。

（3）巰基乙醇。

（4）PVP(聚乙稀吡咯烷酮)。

（5）石英砂。

（6）Trichloromethane：異戊醇（24：1），現(xiàn)用現(xiàn)配。

（7）異丙醇。

（8）75%乙醇。

（9）TE緩沖液：取5ml 2mol/L Tris-HCL和2ml0.5mol/L EDT^.Na₂。用重蒸水定容至1000ml。

（10）RNase A：取100mg RNase溶于10ml含有10mmol/L Tris(pH7.5)-15mmol/L Nacl 的溶液中，于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。

（三）材料

    水稻幼苗或蠶豆幼苗和白菜嫩葉等。

二、實(shí)驗(yàn)程序

（一）操作方法

 1.操作步聚

 （1）在50ml離心管中加入10ml CTAB緩沖液。

 （2）取1~2g新鮮葉片（去主脈）于研缽中，加入0.1gPVP或石英砂，在液氮中迅速研磨成粉末后，把粉末轉(zhuǎn)入帶CTAB緩沖液的離心管中，邊加邊攪拌使之混合均勻。

（3）于65℃水浴保溫0.5~1h。

（4）冷卻至室溫后，加入等體積10mlTrichloromethane異戊醇溶液，顛倒混勻10min。

（5）10000 r/min離心10min，去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。

（6）在上清液中加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積的異丙醇 10ml或2倍體積乙醇，輕緩顛倒混合均勻，于-20℃放置30min。

（7）10000 r/min 4℃離心10min，去上清液。

（8）用2ml75%乙醇洗滌2次去除鹽（可放置-20℃冰箱過液）。

（9）倒去75%乙醇，37℃干燥20分鐘，再溶于600µL TE緩沖液中，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管。

(10)加入3µL RNase A ，37℃保溫30min。

（11）用等體積Trichloromethane異戊醇溶液抽提1~3次。

（12）10000r/min,4℃離心10min，吸取上清。

（13）上清液加入1/10體積4mol/L NaCL溶液后，加入2倍體積無水乙醇，放置20min后，10000r/min,離心5min沉淀DNA。

（14）沉淀用75%乙醇乙洗滌2~3次，37℃保溫箱中干燥后溶于適量的TE緩沖液中備用。

2得率的計(jì)算

由于1OD₂₆₀的DNA濃度為50µg/ml，因此DNA得率可按下公式計(jì)算：

1g新鮮組織的DNA含量=OD₂₆₀×50×溶解體積/組織鮮重（µg DNA/g）。

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