簡(jiǎn)介抗生素曾被廣泛用于獸藥生產(chǎn)中，用于預(yù)防和治 療 疾 病 及 促 生 長(zhǎng) 劑等。抗生素的濫用最終導(dǎo)致牛奶、肉類(lèi)等動(dòng)物源性食品中抗生素殘留量嚴(yán)重超標(biāo)，對(duì)人們健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)?？股氐臍埩魰?huì)導(dǎo)致毒副反應(yīng)，例如過(guò)敏反應(yīng)、皮疹。另外，長(zhǎng)期攝入抗生素殘留的食品，會(huì)導(dǎo)致抗藥性細(xì)菌的傳播。因此，各國(guó)都實(shí)施了動(dòng)物抗生素使用法規(guī)。例如，歐盟和加拿大制定了食品中藥物最高殘留量（MRL），美國(guó)將其稱(chēng)為耐受水平。法規(guī)規(guī)定牛奶中抗生素殘留種類(lèi)包括磺胺類(lèi)、β內(nèi)酰胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯和四環(huán)素。本文中牛奶里各類(lèi)抗生素的*如表 1 所示

本文建立了牛奶中抗生素多殘留的LC/MS/MS測(cè)定方法?？股胤N類(lèi)包括環(huán)丙沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、青霉素 G、氯唑西林、替米考星、泰樂(lè)菌素、紅霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、四環(huán)素和金霉素。以及兩種同位素內(nèi)標(biāo)為環(huán)丙沙星 -d8 和氟尼辛-d3。采用改良的 QuEChERS 方法對(duì)牛奶中抗生素進(jìn)行提取。本方法具有良好的線性，高靈敏度、回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，滿足各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)規(guī)定的牛奶中抗生素類(lèi)殘留*的要求

實(shí)驗(yàn)方法儀器設(shè)備Perkinelmer Altus ™ UPLC® 液 相 系 統(tǒng)， 含 Altus A-30溶 劑 管 理 模 塊、 樣 品 管 理 器 和 柱 溫 箱。 質(zhì) 譜 儀：Perkinelmer QSight ™ 210 三重四極桿質(zhì)譜儀。Simplicity3Q ™軟件平臺(tái)控制所有儀器、采集和處理數(shù)據(jù)。

方法參數(shù)液相色譜方法以及質(zhì)譜離子源參數(shù)見(jiàn)表 2。溶劑、標(biāo)準(zhǔn)物及樣品前處理所用的溶劑、試劑和稀釋液純度均為 LC/MS 級(jí)?？股貥?biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自 Sigma-Aldrich® 公司，并于 4℃冰箱中保存。除了 β- 內(nèi)酰胺類(lèi)使用水作為溶劑外，其余抗生素均使用甲醇配制溶液。β- 內(nèi)酰胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液需保存于塑料瓶中，其余抗生素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液可保存在塑料或玻璃瓶中從 C18 凈化劑購(gòu)于 Supelco 公司。所有母液和工作標(biāo)準(zhǔn)溶液均冷藏保存，并使用 2mL 的棕色進(jìn)樣小瓶，以防止化合物降解。同位素內(nèi)標(biāo)的使用：環(huán)丙沙星-d8用于氟喹諾酮，磺胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)，氟尼辛-d3用于大環(huán)內(nèi)酯和β-內(nèi)酰胺類(lèi)。

采用當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)得有機(jī)牛奶作為空白樣品，并對(duì)不同脂肪含量的 5 種牛奶樣品進(jìn)行抗生素殘留檢測(cè)。采用簡(jiǎn)單改良過(guò) QuEChERS 前處理方法 2,3。具體步驟如下：（1）往 5mL 空白有機(jī)牛奶（已添加標(biāo)準(zhǔn)，濃度為 15ng/mL）中加入 20mL 有機(jī)溶劑（甲醇或乙腈）；（2）渦旋混勻 1min，置于 7800rpm 下離心 10min；（3）移取上清液，加入 1.2mg 的 C18 凈化劑 ，用于除去脂肪；（4）渦旋 5min，7800rpm 下離心 5 分鐘；（5）提取 12.5mL 上清液，于 40℃用氮?dú)獯抵?1.5- 2mL；（6）用 15% 甲醇水溶液定容至 2.5mL，渦旋混勻；（7）過(guò) 0.22µm PVDF 微孔濾膜。本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，待上述步驟 7 完成后在進(jìn)行基質(zhì)配標(biāo)及添加內(nèi)標(biāo)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在 0.1ng/mL-1000ng/mL，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣 5 次，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。

譜參數(shù)優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)研究的目標(biāo)化合物均采用正離子模式的電噴霧模式檢測(cè)。采用蠕動(dòng)泵和液相色譜儀相結(jié)合，以三通連接的方式來(lái)優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)：如氣體流量、離子源溫度以及離子源的位置。蠕動(dòng)泵以10µL/min的流速將0.5μg/mL磺胺甲嘧啶注入質(zhì)譜，液相色譜儀以 0.5mL/min 的流速，溶液為乙腈水溶液（V/V，10/90，含 0.1% 甲酸，5mM 甲酸銨）注入質(zhì)譜中。每個(gè)化合物均采用濃度為 0.5μg/mL 來(lái)優(yōu)化碰撞能量。Q1 和 Q3 的分辨率為 0.7amu。各個(gè)化合的質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表 3，每個(gè)化合物均采集 3 對(duì) MRM 離子對(duì)，以降低假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果

結(jié)果與討論按照上述確定的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)試，各各個(gè)抗生素的校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)及 LOQ 見(jiàn)表 4。各個(gè)抗生素的 LOQ 比法規(guī)中耐受水平還要低至 5-100 倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法*牛奶中抗生素的檢測(cè)要求。圖 1 為牛奶基質(zhì)加標(biāo)樣品（濃度為5ng/mL）中磺胺甲嘧啶的提取離子色譜圖，從圖1可以看出，具有較高的信噪比。采用空白牛奶基質(zhì)作為稀釋液，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（9 個(gè)濃度點(diǎn)），基質(zhì)配標(biāo)曲線范圍為 0.1-1000ng/mL。圖 2 為磺胺二甲嘧啶校準(zhǔn)曲線示例，線性范圍大于 4 個(gè)數(shù)量級(jí)。所有抗生素化合物的校準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù) R2 均大于 0.9958，具有良好的線性關(guān)系。表 5 為目標(biāo)化合物在不同濃度下連續(xù)進(jìn)樣的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)

表 6 展示了牛奶樣品加標(biāo)回收的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、磺胺類(lèi)和 β- 內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素回收率在 70-120% 之間，重現(xiàn)性 RSD 值小于 20%（n=5）。氟喹諾酮的絕對(duì)回收率為 60-70%，但四環(huán)素的絕對(duì)回收率相對(duì)比較低，回收率為 30%。同位素內(nèi)標(biāo)的回收率：環(huán)丙沙星 -d8 和氟尼辛 -d3 分別約 70% 和 90%。氟喹諾酮和氘代氟喹諾酮化合物在提取過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似損失，故使用同位素內(nèi)標(biāo)來(lái)校正氟喹諾酮來(lái)化合物的回收率。采用環(huán)丙沙星 -d8 作為氟喹諾酮和四環(huán)素類(lèi)的內(nèi)標(biāo)物，對(duì)提取過(guò)程的回收率進(jìn)行校正。使用內(nèi)標(biāo)校正后氟喹諾酮的回收率范圍為 80-110%，而四環(huán)素約為 30%。在今后的實(shí)驗(yàn)中可采用氘代四環(huán)素作為四環(huán)素內(nèi)標(biāo)會(huì)得到更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表 6 還展示了不同溶劑的沉淀蛋白效果對(duì)回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響。除了紅霉素外，其余目標(biāo)化合物在乙腈和甲醇中的回收率相近，而紅霉素采用乙腈和甲醇提取的回收率分別約為 27% 和 98%。本文采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液與牛奶基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值之間進(jìn)行比較，以獲得牛奶基質(zhì)效應(yīng)情況。結(jié)果表明：無(wú)論甲醇還是乙腈提取樣品，磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和 β- 內(nèi)酰胺類(lèi)化合物未見(jiàn)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。氟喹諾酮和四環(huán)素均有基質(zhì)增益的效應(yīng)，相對(duì)而言，兩者在甲醇提取的基質(zhì)增益更為顯著。利用上述確定的實(shí)驗(yàn)條件，分析了5個(gè)不同脂肪含量（1%到 5%）的牛奶樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5 個(gè)牛奶樣品均未檢出抗生素。兩種內(nèi)標(biāo)化合物在不同脂肪含量的樣品中，其回收率 RSD 值均小于 15%，這表明：化合物回收率與牛奶中的脂肪含量關(guān)系不大。本實(shí)驗(yàn)對(duì)每個(gè)化合物均監(jiān)測(cè)了 3 對(duì) MRM 離子對(duì)，其中 2 對(duì) MRM 離子對(duì)

用于化合物的定性確證。相對(duì)僅有一對(duì)離子豐度比，擁有兩對(duì) MRM 的離子對(duì)豐度比的實(shí)驗(yàn)，具有更高的選擇性和特異性。定性離子的峰面積與定量離子峰面積比值，作為離子豐度比。表 7 展示了目標(biāo)化合物在牛奶基質(zhì)中的平均離子豐度比。不同濃度水平下的相對(duì)離子比在平均離子豐度比 ±11% 之間，低于食品中化學(xué)殘留物分析SANCO 文件 5 規(guī)定 ±30% 的允許誤差范圍。往牛奶空白樣品提取液中添加標(biāo)準(zhǔn)品，磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和 β- 內(nèi)酰胺類(lèi)的加標(biāo)濃度為 10ng/mL，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)化合物的加標(biāo)濃度為 50ng/mL，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行長(zhǎng)達(dá) 6 天的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。圖 3 展示了牛奶基質(zhì)中10ng/mL 磺胺二甲嘧啶與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值進(jìn)行歸一化的數(shù)據(jù)。在連續(xù) 6 天進(jìn)樣，磺胺二甲嘧啶響應(yīng)值未見(jiàn)明顯下降。實(shí)驗(yàn)表明，該三重四極桿質(zhì)譜儀系統(tǒng)具有優(yōu)異穩(wěn)定性。在 6 天的長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)試顯示 13 種抗生素中有 10 種抗生素的信號(hào)強(qiáng)度無(wú)減弱。另外 3 種抗生素隨著時(shí)間推移而降解，導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度降低 30%。

結(jié)論 參考文獻(xiàn)本文采用改良型 QuEChERS 樣品前處理方法建立了牛奶中抗生素類(lèi)多殘留分析方法，該方法具有快速、穩(wěn)定、可靠，高靈敏度和選擇性等特點(diǎn)。經(jīng)簡(jiǎn)單的樣品前處理，大部分抗生素化合物獲得了良好的回收率。本方法滿足牛奶中痕量的抗生素殘留進(jìn)行定性定量分析要求，具有良好的精密度和穩(wěn)定的保留時(shí)間。長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明：該 LC/MS/MS 系統(tǒng)適用于長(zhǎng)期復(fù)雜基質(zhì)的樣品分析，也無(wú)需停機(jī)維護(hù)保養(yǎng)