人唾液中卡馬西平濃度液相色譜法測定

利用HPLC法測定人唾液中卡馬西平濃度，并觀察其藥代動(dòng)力學(xué)特征. 方法摘要： 采用Shimpack CLCODS C18色譜分析柱 （150 mm×6 mm, 5 μm），以甲醇水（53∶47）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL%26#12539;min-1,檢測波長為212 nm,柱溫為室溫,進(jìn)樣量50 μL. 根據(jù)唾液藥物濃度求算6名健康受試者單劑量口服卡馬西平片劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù). 結(jié)果摘要： 本測定方法線形范圍為0.40~4.32 mg%26#12539;L-1，相關(guān)系數(shù)r=0.999，zui低檢出濃度為30 μg%26#12539;L-1 （按S/N≥3計(jì)），方法平均回收率為99.17%-104.80%；日內(nèi)RSD、日間RSD分別在2.6%-4.9%和3.0%-8.6%. 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)表明，卡馬西平人體內(nèi)過程符合單室開放模型，Tmax, Cmax, ke, T1/2, AUC（0~inf） 分別為（4.50±3.15）h, （1.52±0.22） mg%26#12539;L-1, （0.0090±0.0006） h-1, （77.16±5.26） h, （132.18±8.82） mg%26#12539;h%26#12539;L-1. 單次給藥后，CBZ唾液濃度時(shí)間曲線出現(xiàn)多峰現(xiàn)象. 結(jié)論摘要： 該法簡便、快速、專一性強(qiáng)，適用于卡馬西平唾液藥物濃度測定及藥代動(dòng)力學(xué)探究之用.
　　【 色譜法，高壓液相；卡馬西平；唾液；藥代動(dòng)力學(xué)
　　0引言
　　卡馬西平（carbamazepine， CBZ）是臨床上常用的抗癲癇藥. 由于此藥的藥代動(dòng)力學(xué)個(gè)體差異大，吸收不規(guī)則，血藥濃度治療窗窄（4~12 mg%26#12539;L-1）,輕易引起毒副反應(yīng)［1］. 為保證藥品質(zhì)量及臨床療效，把好臨床合理用藥關(guān)［2-4］，有必要對其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測和個(gè)體化用藥. 但血樣采集常增加患者痛苦，且操作較繁瑣［5］，尤其對于嬰幼兒更為不便. 而唾液取樣具有無創(chuàng)傷、經(jīng)濟(jì)簡便、易于接受等優(yōu)點(diǎn). 為探索用無創(chuàng)傷性生物制品取代血樣的新途徑，通過監(jiān)測唾液中藥物濃度,實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥,并在社區(qū)、家庭推廣，取代傳統(tǒng)的患者到門診抽取血樣的不方便模式，我們利用HPLC法測定卡馬西平唾液濃度，并通過藥代動(dòng)力學(xué)探究，考察其適用性［6］.

　　1材料和方法
　　1.1材料① 對象健康受試者6（男3，女3）名，年齡20~25歲，平均（22.2±1.8）歲；體質(zhì)量42~65 kg，平均（53.7±8.9） kg. 肝腎功能正常，受試前1 wk及受試期間未接受其他藥物. 每位受試者均自愿參加實(shí)驗(yàn)，具體了解實(shí)驗(yàn)過程并簽署知情同意書. ② 儀器LC10AVP液相色譜系統(tǒng)（Shimadzu，Japan）摘要：含兩臺(tái)LC10ATvp型泵，7725型進(jìn)樣閥（配100 μL定量環(huán)），CTO10Asvp柱箱，Classvp 5.032色譜工作站（Shimadzu，Japan），Shimpack CLCODS C18不銹鋼分析色譜柱（150 mm×6 mm，5 μm），3D紫外檢測器；渦旋混合器（XW80型，上海*醫(yī)學(xué)院儀器廠）；高速離心機(jī)（ABBOTT，USA）. ③ 藥品和試劑卡馬西平片摘要：上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20030123卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品摘要：中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜級(jí),其他試劑均為分析純.

　　1.2色譜條件色譜柱摘要：Shimpack CLCODS C18柱（150 mm×6 mm，5 μm）；流動(dòng)相摘要：甲醇水（53∶47）；流速1 mL%26#12539;min-1；檢測波長212 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量100 μL.
　　1.3方法
　　1.3.1CBZ標(biāo)準(zhǔn)液的制備精密稱取4.0 mg的CBZ標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL量瓶中，用甲醇定容，即得濃度為0.08 g%26#12539;L-1的CBZ標(biāo)準(zhǔn)液.
　　1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備取正常人混合空白唾液1 mL 5份，分別加入CBZ標(biāo)準(zhǔn)液5，12，24，38和54 μL，配成濃度分別為0.40，0.96，1.92，3.04和4.32 mg%26#12539;L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品. 取待測樣品150 μL，加入蛋白沉淀劑150 μL，振蕩混勻后高速離心5 min（4500 g）,取上清液100 μL進(jìn)樣. 以峰面積為縱坐標(biāo)（A），CBZ濃度為橫坐標(biāo)（C），進(jìn)行線形回歸，得回歸方程摘要：C=0.000003247A-0.1738（r=0.999， n=6），唾液中CBZ濃度在0.4~4.3 mg%26#12539;L-1范圍內(nèi)線形關(guān)系良好. CBZ的zui低檢測濃度為30 μg%26#12539;L-1（S/N≥3）.
　　1.3.3方法專屬性將空白唾液、CBZ標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試樣品分別進(jìn)樣，其三維圖譜分別見Fig 1. 在本色譜條件下，CBZ的保留時(shí)間為7.2 min，唾液中蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)和CBZ可達(dá)基線*分離，確保分析方法的專一性.
　　1.3.4方法回收率和精密度按“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項(xiàng)下操作，對已知含CBZ 0.40，1.92，4.32 mg %26#12539;L-1低、中、高3種濃度的唾液供試品，于同日內(nèi)連續(xù)測定5次，計(jì)算其日內(nèi)精密度；對上述3種濃度樣品于5 d內(nèi)分別進(jìn)行測定，計(jì)算日間精密度；同時(shí)計(jì)算方法回收率（Tab 1）.
　　1.3.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)6名受試者實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，于次日晨起空腹采集唾液2 mL（空白對照），隨即口服CBZ片劑200 mg；并于服藥后1.5, 3, 4.5, 6, 7.5, 9, 10.5, 12, 24, 72, 144和216 h收集唾液2 mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項(xiàng)下方法測定唾液中CBZ濃度.

　　表1HPLC法測定唾液中卡馬西平的方法回收率和精密度?。裕?br />　　圖1卡馬西平色譜圖?。裕?br />　　2結(jié)果
　　經(jīng)計(jì)算，6名健康受試者口服200 mg CBZ后的平均藥時(shí)曲線見Fig 2. 消除速率常數(shù)ke用消除相中對數(shù)藥物濃度時(shí)間回歸曲線的斜率求得，以梯形法求算AUC, Tmax, Cmax均采用實(shí)測值. 其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tmax, Cmax, ke, T1/2, AUC（0~inf）分別為（4.50±3.15）h, （1.52±0.22） mg%26#12539;L-1, （0.0090±0.0006） h-1, （77.16±5.26） h, （132.18±8.82） mg %26#12539;h%26#12539;L-1.
　　圖2健康受試者口服200 mg卡馬西平后的平均藥時(shí)曲線?。裕?br />　　3討論

　　以HPLC法測定血液中CBZ的方法已有報(bào)道，其樣品預(yù)處理方法主要為液液萃取法［7-11］. 我們采用蛋白沉淀法，較萃取法回收率高，操作簡便快速、價(jià)廉，而且避免了有機(jī)試劑揮發(fā)給操作者帶來的健康損害. 本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法測定唾液中的CBZ濃度，樣品處理方便，出峰快,10 min即可完成1個(gè)樣品分析，分析成本低. CBZ和樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離*，具有較高的專一性. 以峰面積和唾液中藥物濃度之間的線形關(guān)系做定量標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)性好. 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果表明，本法回收*，重現(xiàn)性良好，是一種靈敏、專一、快速、簡便的測定方法.

　　6名健康受試者單劑量口服CBZ片劑200 mg的唾液藥濃度經(jīng)時(shí)變化趨向基本相似，但達(dá)峰時(shí)間具有較大的個(gè)體差異（4.50±3.15） h，和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致［12］，再次證實(shí)了對CBZ進(jìn)行治療藥物監(jiān)測,實(shí)行個(gè)體化用藥的必要性. CBZ服藥后吸收較為迅速，T1/2較長,其人體內(nèi)的藥時(shí)曲線符合一級(jí)吸收的單室模型. 另外，本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CBZ藥時(shí)曲線存在多峰現(xiàn)象，6名受試者中，4人出現(xiàn)三峰，2人出現(xiàn)雙峰，CBZ多峰現(xiàn)象可能和其胃腸道吸收的非齊性 （Unhomogeneous） 和腸肝循環(huán) （Enterhepatic Circulation，EHC）有關(guān)［12，13］. 本次試驗(yàn)只是單劑量給藥,對CBZ片的多峰現(xiàn)象觀察還須在多次給藥達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)的狀態(tài)下繼續(xù)進(jìn)行觀察. 對多峰現(xiàn)象的探究，可為臨床制訂更平安、有效、合理的給藥方案提供依據(jù)，減少不良反應(yīng)的發(fā)生.
　　我們建立了簡便、快速檢測唾液中CBZ的方法，適用性良好，為以唾液進(jìn)行CBZ治療藥物監(jiān)測提供了依據(jù)，也為進(jìn)一步進(jìn)行多中心臨床試驗(yàn)，考察CBZ唾液濃度和CBZ臨床療效及不良反應(yīng)發(fā)生率間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ).