實驗原理:人環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）Elisa試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平。用純化的人環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入環(huán)磷酸鳥苷（cGMP），再與HRP 標記的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中人環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）濃度。

組成:

1.30倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶7 終止液 6ml×1瓶;

2.酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品（96 ng/ml）0.5ml×1瓶;

3.酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1瓶;

4.樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書1份;

5.顯色劑A液 6ml×1 瓶 11 封板膜2張;

6.顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋1個;

標本要求:

1.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能

馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

2.不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟:

1.標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

48 ng/ml 5 號標準品 150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液;

24 ng/ml 4 號標準品 150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液;

12 ng/ml 3 號標準品 150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液;

6 ng/ml 2 號標準品 150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液;

3 ng/ml 1 號標準品 150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液;

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

4.配液:將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用

5.洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.加酶:每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育:操作同3。

8.洗滌:操作同5。

9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15分鐘。

10.終止:每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11.測定:以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15 分鐘以內進行。

操作程序總結：

計算:以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項:

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2.濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3.各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5 分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6.底物請避光保存。

7.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9.本試劑不同批號組分不得混用。

10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

保存條件及有效期:

1.試劑盒保存:2-8℃。

2.有效期:6個月。

人環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）Elisa試劑盒

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