人軟骨糖蛋白39（HCgp-39）ELISA試劑盒說明書
人軟骨糖蛋白39（HCgp-39）ELISA試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷
人軟骨糖蛋白39（HCgp-39）ELISA檢測試劑盒使用說明書
檢測原理:試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被軟骨糖蛋白39（HCgp-39）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的軟骨糖蛋白39（HCgp-39）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法:
1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5.保存:如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品:
1.37℃恒溫箱
2.酶標(biāo)儀（450nm）
3.高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
操作注意事項:
1.濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，zui終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。
2.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
3.嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
4.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
人軟骨糖蛋白39（HCgp-39）ELISA試劑盒組成:
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無
標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無
樣本稀釋液6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
注:標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0、5、10、20、40、80 ng/mL
試劑的準(zhǔn)備:20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1:20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法:
1.自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
操作步驟:
1.從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi)，在450nm 波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
試劑盒性能:
1.重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
2.準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值，大于等于0.9900。
3.靈敏度:zui低檢測濃度小于1.0 ng/mL。
4.特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
5.貯藏:2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期:6個月
